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Einer der Forschungsschwerpunkte des DFG Graduiertenkollegs BioNoCo (1166, Biokatalyse in nicht-konventionellen Medien) besteht in der Enzymexpression und dem Screening nach Varianten mit verbesserten Eigenschaften zur Anwendung in nicht-konventionellen Lösungsmitteln.

Unter Verwendung neuer online-Messtechniken zeigen aktuelle Ergebnisse, dass der Verlauf einer Escherichia coli Kultur stark von dem exprimierten Zielprotein abhängt. In diesen Experimenten sind Wirtsorganismus, Plasmid, Promotor sowie alle weiteren beeinflussenden Komponenten identisch, abgesehen von dem Gen für das rekombinante Protein.

In konventionellen Screening-Protokollen wird das nicht gleichförmige Wachstums- und Expressionsverhalten der Kulturen vernachlässigt, was zu dem Verlust vielversprechender Varianten führen kann. Um einen fairen Vergleich von Screening-Kulturen gewährleisten zu können, ist folglich eine uniforme Expression eines jeden Zielproteins erforderlich.

In diesem Projekt wird zunächst die Inhomogenität verschiedener Screening-Kulturen im Hinblick auf Atmungsaktivität sowie Biomasse- und Produktbildung bewertet. Mit Hilfe der online-Messmethode Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS) [Fig. 1] kann die Sauerstofftransferrate (OTR) gemessen werden, mit der eine Charakterisierung des metabolischen Zustandes eines rekombinanten Organismus möglich ist. Diese Daten sollen dazu verwendet werden, die Kulturen in verschiedene Expressionstypen zu klassifizieren. Das Verständnis der zugrundeliegenden Expressionsmechanismen soll dazu genutzt werden, die verschiedenen Expressionstypen ineinander zu überführen. Der Ansatz, alle Varianten in einen uniformen Expressionstyp zu bringen, soll dabei einen fairen Vergleich in Screening-Programmen erlauben.

Eine Möglichkeit, Unterschiede im Expressionsverhalten verschiedener Klone zu reduzieren, besteht in der Entwicklung individueller Induktionsprofile. Im Weiteren soll in diesem Projekt eine Automatisierung entwickelt werden, bei der eine „individualisierte“ Behandlung verschiedener Stämme mit dem RoboLector, einer Kombination aus der Online-Messmethode BioLector und einem Pipettierroboter [Fig. 2], durchgeführt wird. Nach erfolgreicher Implementierung steht dieses Projekt für die Screening Aufgaben in BioNoCo zur Verfügung.

Fig. 1: Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS) Anlage

 

Fig. 2: RoboLector – eine Kombination aus der Online Messmethode BioLector und einem Pipettierroboter