Einfluss rekombinanter Enzyme auf Expression und metabolische Aktivität des Wirtsorganismus
Einer der Forschungsschwerpunkte des DFG Graduiertenkollegs BioNoCo (1166, Biokatalyse in nicht-konventionellen Medien) besteht in der Enzymexpression und dem Screening nach Varianten mit verbesserten Eigenschaften zur Anwendung in nicht-konventionellen Lösungsmitteln.
Unter Verwendung neuer online-Messtechniken zeigen aktuelle Ergebnisse, dass der Verlauf einer Escherichia coli Kultur stark von dem exprimierten Zielprotein abhängt. In diesen Experimenten sind Wirtsorganismus, Plasmid, Promotor sowie alle weiteren beeinflussenden Komponenten identisch, abgesehen von dem Gen für das rekombinante Protein.
In konventionellen Screening-Protokollen wird das nicht gleichförmige Wachstums- und Expressionsverhalten der Kulturen vernachlässigt, was zu dem Verlust vielversprechender Varianten führen kann. Um einen fairen Vergleich von Screening-Kulturen gewährleisten zu können, ist folglich eine uniforme Expression eines jeden Zielproteins erforderlich.
In diesem Projekt wird zunächst die Inhomogenität verschiedener Screening-Kulturen im Hinblick auf Atmungsaktivität sowie Biomasse- und Produktbildung bewertet. Mit Hilfe der online-Messmethode Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS) [Fig. 1] kann die Sauerstofftransferrate (OTR) gemessen werden, mit der eine Charakterisierung des metabolischen Zustandes eines rekombinanten Organismus möglich ist. Diese Daten sollen dazu verwendet werden, die Kulturen in verschiedene Expressionstypen zu klassifizieren. Das Verständnis der zugrundeliegenden Expressionsmechanismen soll dazu genutzt werden, die verschiedenen Expressionstypen ineinander zu überführen. Der Ansatz, alle Varianten in einen uniformen Expressionstyp zu bringen, soll dabei einen fairen Vergleich in Screening-Programmen erlauben.
Eine Möglichkeit, Unterschiede im Expressionsverhalten verschiedener Klone zu reduzieren, besteht in der Entwicklung individueller Induktionsprofile. Im Weiteren soll in diesem Projekt eine Automatisierung entwickelt werden, bei der eine „individualisierte“ Behandlung verschiedener Stämme mit dem RoboLector, einer Kombination aus der Online-Messmethode BioLector und einem Pipettierroboter [Fig. 2], durchgeführt wird. Nach erfolgreicher Implementierung steht dieses Projekt für die Screening Aufgaben in BioNoCo zur Verfügung.
Fig. 1: Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS) Anlage
Fig. 2: RoboLector – eine Kombination aus der Online Messmethode BioLector und einem Pipettierroboter
Veröffentlichungen
Anderlei T, Büchs J. Device for sterile online measurement of the oxygen transfer rate in shaking flasks. Biochem Eng J. 2001; 7:157-162.
Anderlei T, Zang W, Papaspyrou M, Büchs J. Online respiration activity measurement (OTR, CTR, RQ) in shake flasks. Biochem Eng J. 2004;17:187–194.
Huber R, Ritter D, Hering T, Hillmer AK, Kensy F, Muller C, Wang L, Büchs J. Robo-Lector—a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact. 2009;8:42.
Kensy F, Engelbrecht C, Büchs J. Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli and Hansenula polymorpha fermentations. Microb Cell Fact. 2009;8:68.
Kunze M, Huber R, Gutjahr C, Müllner C, Büchs J. Predictive tool for recombinant protein production in Escherichia coli shake-flask cultures using an on-line monitoring system. Biotechnol Prog. 2012; 28(1):103-13.
Samorski M, Muller-Newen G, Büchs J. Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: a novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 2005; 92:61-68.