Monitoring, characterizing, and influencing the poly(γ-glutamic acid) production by Bacillus licheniformis

  • Monitoring, Charakterisierung und Beeinflussung der γ-Polyglutaminsäureproduktion von Bacillus licheniformis

Meißner, Lena Elisabeth; Büchs, Jochen (Thesis advisor); Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Aachen (2016)
Doktorarbeit

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2016

Kurzfassung

Bei der Produktion industrieller Enzyme werden sehr häufig Arten der Gattung Bacillus eingesetzt. Diese Bacillus-Arten sind allerdings auch dafür bekannt, das Biopolymer γ-Polyglutaminsäure (γ-PGA) herstellen zu können. Die Bildung von Biopolymeren erhöht die Viskosität des Fermentationsmediums und beeinflusst die Durchmischung, den Wärmeaustausch und den Massentransfer zwischen Gas- und Flüssigphase im Bioreaktor. Eine unerwünschte Biopolymerbildung hat sowohl großen Einfluss auf die Fermentation als auch auf die anschließende Produktaufarbeitung. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie die unerwünschte γ-PGA-Bildung eines industriellen Bacillus licheniformis Proteaseproduktionsstamms (A1) unterdrückt werden kann, indem als Stickstoffquelle Nitrat anstelle von Ammonium eingesetzt wird. Dadurch konnte die Viskosität des Mediums um über 90 % gesenkt werden, während sich die Proteaseaktivität durch den Austausch der Stickstoffquelle nicht veränderte. Es wurden Proteaseaktivitäten von 38 und 46 U mL-1 für Ammonium und Nitrat erreicht. Es wurde die Anwendbarkeit für Kultivierungen im Schüttelkolben und im 3 L Rührkessel gezeigt. Die erzielten Erkenntnisse ermöglichen es, in Zukunft industrielle Produktionsprozesse zur Proteaseherstellung mit Bacillus-Stämmen durchzuführen, ohne das Schüttelkolben- und Rührkesselfermentation durch unerwünschte γ-PGA-Bildung gestört werden. Bacillus-Arten werden aber nicht nur zur Enzymproduktion, sondern auch zur industriellen Produktion des Biopolymers γ-PGA eingesetzt. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich daher mit der Charakterisierung eines typischen γ-PGA-produzierenden Bacillus licheniformis Stammes (ATCC 9945), der in Schüttelkolbenexperimenten unter sogenannten Standardbedingungen kultiviert wurde, die aus der entsprechenden Literatur übernommen wurden. Es zeigte sich, dass unter diesen Bedingungen eine starke Sauerstofflimitierung vorlag, und dass nach einer gewissen Kultivierungszeit die Sauerstofftransferraten (OTR) der bis dahin sehr ähnlich gelaufenen Kulturen unterschiedlich verliefen. Einige der Kulturen stellten ihre Atmungsaktivität vergleichsweise früh ein, während andere Kulturen noch mehrere Tage Atmungsaktivität zeigten. Ein frühes Einbrechen der OTR konnte dabei immer mit einem sehr niedrigen pH-Wert assoziiert werden. Die offline gemessene, effektive Viskosität diente als Maß für die γ-PGA-Bildung. Die maximale effektive Viskosität wurde nach 24 bis 48 h gemessen. Das Aufspalten der OTR-Kurven der bis dahin gleich gewachsenen Kulturen trat erst anschließend auf. Das nicht reproduzierbare Verhalten der Kulturen hatte somit keinen Einfluss auf die Produktbildung. Nach Erreichen der maximalen effektiven Viskosität war immer ein deutlicher Abfall der Viskosität zu beobachten, der auf den Beginn des enzymatischen γ-PGA-Abbaus hinwies. Der Zeitpunkt der maximalen effektiven Viskosität korrelierte mit einem vollständigen Verbrauch von Zitronensäure und Phosphat. Verschiedene Medienzusammensetzungen und Füllvolumina wurden im Hinblick auf ihren Einfluss auf die γ-PGA-Bildung untersucht. Eine höhere Zitronensäurekonzentration im Medium führte zu einer deutlichen Erhöhung der maximalen Viskosität, während eine höhere Phosphatkonzentration unter Standardbedingungen keinen Einfluss zeigte. Eine Kombination aus erhöhter Zitronensäure- und Phosphatkonzentration hatte hingegen einen zusätzlichen positiven Effekt. Die Kombination aus erhöhter Zitronensäure- und Ammoniumkonzentration führte jedoch zu niedrigen pH-Werten und daraus resultierend zu einem frühen Einbruch der OTR. Durch verschiedene Füllvolumina konnten unterschiedliche Niveaus einer Sauerstofflimitierung bzw. nicht sauerstofflimitierte Bedingungen eingestellt werden. Die verschiedenen Bedingungen hatten einen starken Einfluss auf Wachstum und γ-PGA-Bildung, wobei ein gewisses Maß an Sauerstofflimitierung von Vorteil für die γ-PGA-Bildung war. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde ein Orbitalschüttler mit einem Drehmomentsensor zur Leistungseintragsmessung eingesetzt, um die γ-PGA-Bildung und den Abbau online zu verfolgen. Der online gemessene, volumetrische Leistungseintrag korrelierte hier sehr gut mit der offline bestimmten, effektiven Viskosität. Messungen des Molekulargewichts und der γ-PGA-Konzentration zeigten dabei, dass Viskosität und Leistungseintrag stärker von Änderungen des Molekulargewichts als von Konzentrationsänderungen beeinflusst wurden. Eine höhere Viskosität aufgrund einer höheren Zitronensäurekonzentration oder der Zugabe von Spurenelementen ließ sich mit Hilfe des Leistungseintragssignals nachweisen. Darüber hinaus zeigte der Vergleich der Stämme ATCC 9945 und A1, dass verschiedene Stämme unterschiedliche γ-PGA-Bildungskinetiken aufweisen können, die durch die Leistungseintragsmessung sehr gut erfasst wurden. Abschließend konnte eine Korrelationsgleichung aus den Daten der offline bestimmten Viskosität und des online gemessenen Leistungseintrags aufgestellt werden, die die Berechnung eines kontinuierlichen Viskositätsverlaufs aus den Leistungseintragsdaten ermöglicht.

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