High-throughput live-cell imaging for investigations of cellular heterogeneity in Corynebacterium glutamicum

  • Hochdurchsatz Live Cell Imaging für Untersuchungen zellulärer Heterogenität in Corynebacterium glutamicum

Helfrich, Stefan; Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor); Usadel, Björn (Thesis advisor)

Jülich : Forschungszentrum Jülich GmbH (2016)
Doktorarbeit

In: Schriften des Forschungszentrums Jülich. Reihe Schlüsseltechnologien 130
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (xvi, 217 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Kurzfassung

In den vergangenen 15 Jahren wurden signifikante Unterschiede zwischen einzelnen Zellen im Bezug auf Wachstum, Stressresistenz und andere zelluläre Merkmale in monoklonalen Bakterienpopulationen beobachtet. Fortschritte in Mikrofluidik und Mikroskopie ermöglichen es die Entwicklung einzelner Zellen mit bisher nicht gekannter räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen. In Verbindung mit optimierten, mikrofluidischen Labs-on-a-Chip, können hunderte Bakterienpopulationen unter kontrollierten Umweltbedingungen kultiviert und Bildsequenzen aufgezeichnet werden. Mit der Möglichkeit große Datenmengen automatisiert zu erzeugen, ist die Auswertung der Bilddaten zu dem entscheidenden Schritt für die Erhebung von quantitativen, zeitaufgelösten Informationen geworden. Daher wurde eine erweiterbare Bildanalyse- Pipeline für die Auswertung von Bildsequenzen des biotechnologischen Modellorganismus Corynebacterium glutamicum entwickelt. Die Pipeline ist für die Identifizierung von Zellen in gedrängten Umgebungen optimiert, sowie für das Tracking von Zellen bei großer räumlicher Verschiebung. Zusätzlich können eine Vielzahl von Zelleigenschaften, wie zum Beispiel morphologische Parameter und Fluoreszenzintensitäten, extrahiert werden. Die Bildanalysepipeline ist als Plugin für die ImageJ(2) Plattform implementiert worden. ImageJ(2) stellt fortschrittliche Datenstrukturen zu Verfügung und ermöglicht das Steuern von Abläufen mit Hilfe einer graphischen Benutzeroberfläche. Die zugrundeliegende Service-Architektur fördert die Erweiterbarkeit und Flexibilität von Modulen, so dass diese auch in anderen Plugins verwendet werden können. Mit einer Kombination aus Mikrofluidik, Live-Cell Imaging Verfahren und Bildanalysetechniken ist man in der Lage Heterogenität in mikrobiellen Populationen auch bei niedriger zeitlicher Auflösung zu quantifizieren. Während die Analyseplattform für eine Vielzahl von Untersuchungen angewendet wurde, liegt der Fokus in dieser Arbeit auf zwei Anwendungsfeldern: mikrobielles Wachstum und Morphologie sowie Prophageninduktion in C. glutamicum. Im Rahmen der Wachstumsstudien wird die Übertragbarkeit von etablierten Quantifizierungsmethoden auf Einzelzelldaten untersucht. Eine zweite Anwendung auf diesem Gebiet überträgt die gewonnenen Erkenntnisse auf eine Screening-Studie von C. glutamicum, in welcher der Einfluss der Medienkomposition auf das Wachstum und die morphologischen Parameter untersucht wird.In einem zweiten Anwendungsfeld wird eine Analyse der mikrobiellen Stressantwort und die Induktion eines Prophagen in C. glutamicum beleuchtet. Zu diesem Zweck ist ein Dual-Reporter-Stamm (d.h. ein Stamm mit beiden Reportern für SOS-Antwort und Prophagen-Induktion) in mikrofluidischen Labs-on-a-Chip kultiviert und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert worden. Aus den zeitaufgelösten Reporterdaten wurde ein Zellzustandsmodell abgeleitet, welches für die Populationsmodellierung von C. glutamicum verwendet wurde.

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