Robot-assisted phenotyping of genome-reduced Corynebacterium glutamicum strain libraries to draft a chassis organism

• Robotergestützte Phänotypisierung genomreduzierter Corynebacterium glutamicum Stämme zur Konstruktion eines Chassis-Organismus

Unthan, Simon; Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor); Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Jülich : Forschungszentrum Jülich GmbH, Zentralbibliothek (2016)
Doktorarbeit

In: Schriften des Forschungszentrums Jülich. Reihe Schlüsseltechnologien / Key Technologies 132
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (122 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2015

Kurzfassung

Die vorliegende Promotionsarbeit war integraler Bestandteil eines vom BMBF geförderten Verbundprojektes zur Genomreduktion von Corynebacterium glutamicum. Ziel war die Entwicklung und Anwendung von Strategien zur Konstruktion eines Chassis-Organismus durch Identifikation und Deletion irrelevanter Gencluster. Zielkriterium der konstruierten Stämme war deren unveränderte biologische Fitness gegenüber der Wildtyp-Form, beurteilt über spezifische Wachstumsgeschwindigkeit und Biomasseausbeute, beim Wachstum auf definiertem CGXII Medium mit D-Glukose.Unter Verwendung des am IBG-1 verfügbaren Mini Pilot Plant wurden Prozesse zur schnellen Stamm-Phänotypisierung automatisiert und standardisiert. Dazu zählen insbesondere die Schwellwert-abhängige Ernte von zellfreien Überständen aus Mikrotiterplatten-Kultivierungen sowie die parallele Quantifizierung von D-Glukoseund Aminosäuren im 384-well Mikrotiterplatten-Maßstab [1].In ersten Referenzexperimenten wurde Protocatechuat als verborgenes Co-Substrat im CGXII Medium identifiziert. In verdünnten Kulturen erhöht der zusätzliche Kohlenstofffluss aus Protocatechuat über Acetyl-CoA und Succinyl-CoA in den Zitratzyklus die Wachstumsgeschwindigkeit von C. glutamicum um etwa 50 % [2].Zu Beginn der Konstruktion eines Chassis-Organismus wurden drei Prophagen aus dem Wildtyp und damit 6.7 % des Genoms von C. glutamicum deletiert. Der resultierende Stamm MB001 zeigte eine unveränderte biologische Fitness sowie eine gesteigerte spezifische Expression heterologer Proteine. Weitere Untersuchungen zeigten, dass diese Steigerung vermutlich durch die Entfernung eines Restriktions- und Modifikationssytems verursacht wurde, welches im Prophagen CGP3 lokalisiert ist [3].Anschließend wurden 36 nicht-essentielle Gencluster aus dem Stamm MB001 deletiert. Durch Phänotypisierung der Mutanten-Stämme konnten 26 irrelevante Gencluster identifiziert werden, wobei durch deren komplette Deletion das Genom von C. glutamicum um insgesamt 22 % reduziert werden könnte [4]. Parallel wurdenausgewählte Gencluster auch aus dem L-Lysin Modellproduzenten DM1933 deletiert. Hierbei zeigte der genomreduzierte Stamm GRLP45 in der Mikrotiterplatte um 51 % erhöhte L-Lysintiter, was im geregelten Bioreaktorsystem bestätigt werden konnte [1].Bei Untersuchungen von Stämmen mit kombinatorischen Deletionen irrelevanter Gencluster wurden teilweise Abhängigkeiten einzelner Gencluster identifiziert, welche zu einer verringerten biologischen Fitness der betreffenden Mutanten führten. Die detaillierte Charakterisierung der Mutante W65 zeigte einen Zusammenhang zwischen der Anzahl Ribosomen-kodierender Sequenzen und der maximalen Wachstumsrate.Schließlich konnten die Kombinationsstämme W127 und W121 identifiziert werden, welche eine Genomreduktion von 8.8 % und 12.8 % aufweisen, welche das gesetzte biologische Fitnesskriterium erfüllen. W121 zeigte eine veränderte Morphologie, deren Ursache über die Stammdatenbank des Projektes auf ein einzelnes Gencluster eingegrenzt werden konnte. Stamm W127 zeigte hingegen auch unter Stressbedingungen unverändertes Wachstum und stellt eine geeignete strukturelle Basis für zukünftige Arbeiten der synthetischen Biologie mit C. glutamicum dar.

Einrichtungen

• Lehrstuhl für Computational Systems Biotechnology (FZ Jülich) [420410]