Process Integration, Assessment, and Online Monitoring of Biotechnological Itaconic Acid Production

  • Prozessintegration, -evaluierung und Online-Monitoring der biotechnologischen Itaconsäureproduktion

Kreyenschulte, Dirk Herbert; Büchs, Jochen (Thesis advisor); Krull, Rainer (Thesis advisor)

Aachen (2016)
Doktorarbeit

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2016

Kurzfassung

Durch die voranschreitende Etablierung einer biobasierten Ökonomie sowie die Umstellung von Petrochemikalien auf Produkte aus erneuerbaren Ressourcen hat die fermentative Umsetzung von Zuckern und anderen Rohstoffen in den letzten Jahren immens an Bedeutung gewonnen. Als eine der vielversprechendsten Plattformchemikalien aus pflanzlicher Biomasse hat Itaconsäure dabei großes Potential für die Produktion vielseitig anwendbarer, biobasierter Polymere sowie den Ersatz Petrochemie-basierter Materialien wie z.B. Acrylsäure. In Bezug auf die biotechnologische Itaconsäureproduktion werden jedoch neue, innovative Prozesse benötigt, um die Profitabilität und Wettbewerbsfähigkeit in zukünftigen Märkten zu steigern. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit Prozessintegration, -evaluierung und Online-Monitoring der Itaconsäureproduktion untersucht.Vor Durchführung der submersen Itaconsäureproduktion wurde die Herstellung geeigneter Seedingkulturen für die Kultivierung von Aspergillus terreus untersucht. Dafür wurde das häufig verwendete Czapek-Dox-Agarmedium modifiziert, um eine reproduzierbare Sporulation zu gewährleisten. Anschließend wurde die Kultivierung von A. terreus in schikanelosen Schüttelkolben sowie im gerührten 3L-Bioreaktor etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass die Online-Messung des respiratorischen Quotienten ein direktes Maß für die Bildung von Itaconsäure ist. Dadurch konnten Phasen starker Itaconsäureproduktion sowie negative Auswirkungen einer Produktinhibierung online identifiziert werden. Um den negativen Einfluss der Produktinhibierung abzuschwächen, wurde die Anwendbarkeit einer Reaktivextraktion zur In-situ-Produktabführung untersucht. Zunächst wurde die Biokompatibilität diverser Lösungsmittel anhand der respiratorischen Aktivität von A. terreus bewertet. Infolgedessen wurde eine Mischung aus dem Extraktionsmittel Trioctylamin und dem Trägerlösungsmittel Isopropylmyristat für weitere Experimente verwendet. Eine erhöhte Menge an Trioctylamin führte zu einem Anstieg der Extraktionseffizienz bezüglich der Itaconsäure. Der durch die basischen Eigenschaften des Trioctylamins hervorgerufene Anstieg des pH-Wertes wirkte diesem Effekt jedoch entgegen. Abgesehen von der Reaktivextraktion wurde auch die Machbarkeit einer Rückextraktion von Itaconsäure in eine wässrige Trimethylaminlösung bestätigt. Schließlich wurde die Reaktivextraktion durch Lösungsmittelzugabe nach 63 Stunden erfolgreich in die Kultivierung von A. terreus integriert. Als Folge des erhöhten pH-Wertes und der verringerten Itaconsäurekonzentration konnten Substratverbrauch und Produktbildung deutlich gesteigert werden. In Verbindung mit einer erhöhten Menge an Glucose, welche entweder zu Beginn oder während der Kultivierung zugegeben wurde, konnte durch In-situ-Reaktivextraktion die gesamte Itaconsäurekonzentration von 70 auf 105 g/L gesteigert werden. Gleichzeitig stieg die volumetrische Produktivität von 0,72 auf 0,91 g/L/h. Mit der In-situ-Reaktivextraktion konnte somit ein äußerst vielversprechendes Mittel zur In-situ-Produktabführung etabliert werden, das noch großes Potential bezüglich einer weiteren Optimierung aufweist.Im Verlauf der Evaluierung der potentiellen Wirtschaftlichkeit und Machbarkeit neuer Produktionswege können aerobe Fermentationsprozesse einen deutlichen Anteil an den Betriebskosten des Gesamtprozesses haben. Die genaue Abschätzung des betreffenden Energiebedarfs ist daher von großer Wichtigkeit. Hierzu wurde basierend auf etablierten Korrelationen und Gleichungen ein Modell entwickelt, in welchem die relevanten Parameter und Bedingungen für den Betrieb von Bioreaktoren berücksichtig wurden. Die Analyse wurde für großtechnische Reaktoren (10 – 100 m³) durchgeführt, wobei die Sauerstofftransferrate aus Versuchen im kleinen Maßstab als Scale-up-Kriterium diente. Unter den untersuchten Bedingungen stellte sich heraus, dass der Flutpunkt des Bioreaktors das maßgebliche Kriterium für Arbeitsvolumina von mehr als 20 m³ ist. Minimaler Energiebedarf für Kühlung, Durchmischung und Begasung des Reaktors konnte somit durch vergleichsweise geringe Drehzahlen und hohe Begasungsraten erreicht werden. Bei geringem Sauerstoffbedarf konnte die Erhöhung des Drucks die Energieeffizienz aerober Prozesse nicht steigern. Für Prozesse mit hohem Sauerstoffbedarf und einer Tendenz zu Schaumbildung war eine Druckerhöhung dagegen unerlässlich. Das entwickelte Modell wurde abschließend zur Evaluierung der biotechnologischen Itaconsäure- sowie Lysinproduktion angewandt. Durch den unterschiedlich starken Sauerstoffbedarf beider Prozesse wurde ein mittlerer Energiebedarf von 0,51 kW/m³ (Itaconsäure) bzw. 2,61 kW/m³ (Lysin) ermittelt. Die große Differenz spricht somit gegen die Verwendung genereller Daumenwerte zur Abschätzung aerober Fermentationsprozesse. Das hier entwickelte Modell stellt daher ein effizientes Mittel dar, um die Evaluierung des Energiebedarfs für den jeweils untersuchten Prozess zu spezifizieren.Zur Entwicklung neuer biotechnologischer Prozesse werden sowohl in der universitären Forschung als auch in der Industrie neue Methoden der Online-Analytik benötigt, welche eine Charakterisierung sowie Kontrolle der Prozesse erlauben. Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie) ist dabei ein vielversprechendes analytisches Verfahren, das bereits breite Anwendung in der Offline-Analyse vieler Prozesse findet. Die Verwendung in der Online-Analytik wird jedoch in der Regel durch die hohe Komplexität individuell gefertigter NMR-Bioreaktoren sowie die beträchtlichen Kosten für Hochfeld-NMR-Geräte (> 200.000 US-Dollar) eingeschränkt. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Anwendbarkeit eines Niederfeld-1H-NMR-Spektrometers in einem Bypass zur Echtzeit-Überwachung von Fermentationsprozessen untersucht. Die neue Methode wurde durch die Verwendung von zwei unterschiedlichen mikrobiellen Systemen validiert. Zum einen konnte der Verbrauch von Glycerin durch die Hefe Hansenula polymorpha trotz der Anwesenheit komplexer Medienbestandteile genau verfolgt werden. Des Weiteren war es möglich während der Kultivierung des Pilzes Ustilago maydis, welche durch die Bildung diverser Nebenprodukte charakterisiert ist, die Konzentrationen von Glucose und Itaconsäure sowie die relative Menge an Glycolipiden zu bestimmen. Obwohl die Niederfeld-Spektren im Vergleich zur Hochfeld-NMR-Spektroskopie durch eine geringere Auflösung gekennzeichnet waren, erlaubte das kompakte Design in Verbund mit der hohen zeitlichen Auflösung der Messung (15 s bis 8 min) das Online-Monitoring der jeweiligen Prozesse. Beide Anwendungen zeigen somit, dass die untersuchte Methode sehr gut für die Überwachung von Reaktionen in trüben Medien geeignet ist und gleichzeitig eine hohe Robustheit und Spezifität aufweist. Die Niederfeld-NMR-Spektroskopie hat daher ein großes Potential für das nicht-invasive Online-Monitoring biotechnologischer Prozesse im kleinen sowie großen Maßstab. Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit neue Konzepte und Methoden zur Prozessintegration, -evaluierung und zum Online-Monitoring der biotechnologischen Itaconsäureproduktion etabliert werden. Diese Aspekte sowie die jeweils erforderliche Methodik weisen zwar große Unterschiede auf, eine Kombination und Optimierung dieser Punkte sollte jedoch grundlegend zur Etablierung der nächsten Generation der Itaconsäureproduktion beitragen.

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