Tandem-mass-spectrometry-driven investigation of the anaplerotic reactions in Corynebacterium glutamicum

  • Tandem Massenspektrometrie getriebene Untersuchung der anaplerotischen Reaktionen in Corynebacterium glutamicum

Kappelmann, Jannick; Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor); Takors, Ralf (Thesis advisor)

Aachen (2018)
Doktorarbeit

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2018

Kurzfassung

Die anaplerotischen Reaktionen bilden ein zyklisches Reaktionsnetzwerk um die Metabolite Phosphoenolpyruvat, Pyruvat, Oxaloacetat und Malat, dessen Carboxylierungs- und Decarboxylierungsreaktionen eine Verbindung zwischen Glykolyse und Tricarbonsäure (TCA)-Zyklus herstellen. Die Netto-Aktivität der anaplerotischen Carboxylierung ist essentiell zur Bereitstellung von TCA- Zyklus Intermediaten und ist daher limitierend für die Biosynthese von aus letzteren abgeleiteten Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat. Der Großteil der Weltproduktion dieser beiden Aminosäuren wird durch die biotechnologische Nutzung von Corynebacterium glutamicum bestritten, einem Arbeitspferd der Biotechnologie und Modellorganismus der Systembiologie gleichermaßen. Die herausragende Bedeutung der anaplerotischen Reaktionen für die biotechnologische Nutzung von C. glutamicum motiviert diese Arbeit. Einleitend klärt eine theoretische Untersuchung die Ursache für erfolglos bestimmte anaplerotische Aktivitäten mittels 13C-Metabolischer Stoffflussanalyse (13C-MFA) in vorherigen Studien auf. Unter Nutzung einer fokussierten Isotopomer-Bilanz des anaplerotischen Reaktionsnetzwerkes kann ohne Beschränkung der Allgemeinheit gezeigt werden, dass für C. glutamicum lediglich Deletionsmutanten in anaplerotischen Reaktionen eine eindeutige Bestimmung der anaplerotischen Flüsse aus stationären isotopischen 13C-Markierungsdaten zulassen. Dieser Befund erzwang die Untersuchung einer Sammlung von Einzel- und Doppeldeletionsmutanten, deren Metabolismus mittels Triple Quadrupol-Masspenspektrometrie (QqQ MS) untersucht wurde. Mittels Quadrupole-Flugzeit-Massenspektrometrie (QqTOF MS) wurde ein Proteom-Datensatz erzeugt, aus dem unter Nutzung eines Regressionsansatzes präzise relative Änderungen für ein knappes Drittel der Proteine von C. glutamicum geschätzt wurden. Eine wesentliche biologische Erkenntnis aus der Gesamtheit der Daten besteht in dem rigorosen Nachweis, dass der Glyoxylat-Zyklus als anaplerotische Reaktion unter ausschließlich glykolytischen Bedingungen in C. glutamicum aktiv sein kann, was durch eine Metabolit-Protein Interaktion und keine Mutation der relevanten Regulatoren vermittelt wird. Der Befund einer inkonsistenten Flussschätzung im Rahmen einer 13C-MFA der untersuchten Stämme veranlasste die Entwicklung einer neuen QqTOF MS-basierten Akquisitionsmethode, die die Kollisions-induzierte Dissoziation (CID) von Anionen des Zentralstoffwechsels und Kationen von Aminosäuren zur positionsaufgelösten 13C-Markierungsmessung nutzt. Zu diesem Zweck wurden akkurate Massenspektrometrie, selektiv-markierte Standards und publizierte Fragmentierungswege genutzt, um alle dominanten Massenpeaks einer großen Auswahl von Metaboliten strukturell zu annotieren. Die vorgenommene Analyse stellt die detaillierteste Beschreibung des Verbleibs von Kohlenstoffatomen in LC-ESI-MS/MS Fragmenten dar. Über die Positionsauflösung hinaus, kann gezeigt werden, dass die CID von Aminosäuren dazu genutzt werden kann, 13C- und 15N-Massenisotopomere dieser Metabolitklasse analytisch zu trennen, ohne sie in der m/z-Domäne aufzulösen.

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