Model-based experimental analysis of enzymatic reaction networks

  • Modellbasierte experimentelle Analyse von enzymkatalysierten Reaktionsnetzwerken

Ohs, Rüdiger Björn Harald; Spieß, Antje (Thesis advisor); Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2020

Kurzfassung

Die kinetische Beschreibung von enzymkatalysierten Reaktionen ist eine zentrale Aufgabe in der Biotechnologie und Bioverfahrenstechnik. Insbesondere mechanistische Modelle unterstützen bei der Anwendung neu entdeckter Biokatalysatoren. Diese Arbeit zielt darauf ab, die kinetische Identifikation von enzymkatalysierten Reaktionsnetzwerken im Allgemeinen und das kinetische Verständnis von ThDP-abhängigen Enzymen im Speziellen voranzutreiben. Letztere katalysieren vielseitige Reaktionen mit hoher Enantioselektivität, jedoch ist ihr kinetisches Verständnis noch unzureichend. Die Entwicklung kinetischer Modelle umfasst die Herleitung von Modellgleichungen, Versuchsdurchführung, Parameterschätzung und Modellanalyse. Dabei erlauben optimal geplante (OED) Verlaufskurvenexperimente eine effiziente Bestimmung von Enzymkinetiken. Es ist jedoch nur schwer nachvollziehbar, warum bestimmte Versuche für die nichtlinearen enzymkinetischen Modelle vorgeschlagen werden. Um dieses Verständnis von OEDs zu verbessern, wurden verschiedene Optimalitätskriterien systematisch mit Hilfe von Oberflächen- und Konturdiagrammen untersucht. Die Visualisierung erlaubte das Ableiten von Heuristiken für die Identifikation von Enzymkinetiken. Die entwickelten OED-Routinen wurden im Anschluss für die kinetische Analyse der Selbstligation von Benzaldehyd zu (R)-Benzoin angewendet. Die Selbstligation wird durch die Benzaldehydlyase aus dem Pseudomonas Flourescens (PfBAL) katalysiert, wobei jedoch das Substrat die PfBAL inaktiviert. Da bisher nur wenige mechanistische Modelle für die Beschreibung von Karboligationen bei gleichzeitiger Inaktivierung des Biokatalysators zur Verfügung stehen, wurde die Reaktionskinetik und Inaktivierung gleichzeitig aus Verlaufskurvenexperimenten bestimmt. Ein OED steigerte die Parametergenauigkeit und hielt die notwendige Versuchsanzahl moderat. Diese Ergebnisse und zuvor veröffentlichte Versuche für das Substrat 3,5-Dimethoxybenzaldehyd dienten dazu, den Einfluss verschiedener Modellgleichungen bzw. von Modellen mit und ohne Enzyminaktivierung auf die Parameterwerte zu untersuchen. Die Analyse zeigt Strickfallen bei der Interpretation von enzymkinetischen Parametern auf und schlägt eine Strategie für das Datenmanagement und die Validierung von kinetischen Modellen vor. ThDP-abhängige Enzyme katalysieren zudem verzweigte Reaktionsnetzwerke, die beginnend von einem zentralen Intermediat über alternative Reaktionspfade in zwei unterschiedlichen Produkten enden. Die weitverbreitete Cleland-Notation für lineare Reaktionen wurde für solche Reaktionssysteme erweitert und erstmalig explizite Reaktionsgleichungen für zwei gekoppelte geordnete Bi Uni Reaktionen abgeleitet. Die Entwicklung von Modellgleichungen für verzweigte Reaktionsnetzwerke wurde mit automatisierten Routinen zusätzlich vereinfacht. Mit den neuen Modellgleichungen konnte eine modellbasierte experimentelle Analyse für die PfBAL katalysierte Kreuzkarboligation von Benzaldehyd und Propanal zu (R)-2-Hydroxy-1-phenylbutan-1-on durchgeführt werden. Diese Reaktion kann mechanistisch modelliert werden und führt zu sinnvollen kinetischen Parametern.

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