Submerged vinegar fermentation in small scale culture systems

Schlepütz, Tino; Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2013)
Doktorarbeit

Kurzfassung

Industriell wird Essig weitgehend durch submerse Fermentation hergestellt. Obwohl diese im großen Maßstab etabliert ist, fehlen Kleinkulturmethoden, in denen heutzutage Bioprozesse entwickelt und optimiert werden. Um den etablierten Fermentationsprozess neu zu beforschen, war die Entwicklung von geeigneten Kleinkulturmethoden und Systemen für die submerse Essigfermentation das Ziel dieser Arbeit. Da die obligat aeroben Essigsäurebakterien in der Essigherstellung bei herkömmlichen Animpfschritten selbst unter kurzem Sauerstoffmangel leiden, ist die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus der Hauptkultur unzureichend. Durch Gewährleistung eines ständigen Sauerstoffeintrags beim Animpfen wurde eine reproduzierbare Kleinkulturmethode für obligat aerobe Essigsäurebakterien unter industriell relevant hohen Ethanol- und Essigsäurekonzentration entwickelt. Die Vorkultur wurde aus einem 9 L-Bioreaktor in eine begaste, mobile Blasensäule abgelassen und in eine bereits schüttelnde RAMOS-Anlage überführt. Die Atmungskurven herkömmlich behandelter Essigsäurebakterienkulturen waren niedrig und wichen stark voneinander ab. Die Atmungskurven der Essigsäurebakterienkulturen, bei denen die Vorkultur zuerst in die Blasensäule und dann in die bereits schüttelnden Schüttelkolben überführt wurde, waren hoch und überlagerten sich. Ein Abstellen der Begasung in der mobilen Blasensäule führte zu einem rapiden Abfall der Bakterienaktivität. Zusammenfassend sind herkömmliche Animpfverfahren für die Essigsäurebakterien in der Essigfermentation nicht geeignet. Das Aufrechthalten des Sauerstoffeintrags ist erforderlich, um die Reproduzierbarkeit der Hauptkulturexperimente mit diesen Bakterien zu gewährleisten. Industriell wird Essig in Repeated-batch- oder Repeated-fed-batch-Verfahren hergestellt. Bisher gab es keine Kleinkultursysteme für Repeated-batch-Bioprozesse. Deshalb wurde ein neues geschütteltes Kultivierungssystem für die parallele Repeated-batch-Essigfermentation erforscht. Ein neuer Betriebsmodus – der „Flushing-repeated-Batch“ – wurde entwickelt. Die parallele Repeated-batch-Essigfermentation konnte automatisiert in geschüttelten Überlaufgefäßen mit nur einer Pumpe pro Reaktor etabliert werden. Das Flushing-repeated-batch-Verfahren wurde theoretisch betrachtet und realisiert. Die Ethanolkonzentration wurde während der Repeated-batch-Fermentation mit Halbleitergassensoren gemessen. Das Umstellen von einer Alkoholcharge auf andere Alkoholchargen resultierte in verlängerten Lag-Phasen und Dauern der ersten Batch-Zyklen. In den nachfolgenden Batch-Zyklen nahmen die Fermentationszeiten beachtlich ab. Diese Abnahme der entsprechenden Lag-Phasen deutet auf eine Adaptation der gemischten Essigsäurebakterienkultur an die spezifische Alkoholcharge hin. Folglich sind Flushing-repeated-batch-Fermentationen in kleinem Maßstab nützlich, um Fermentationsbedingungen zu screenen und Bioprozesse hinsichtlich der Robustheit, Stabilität und Produktivität zu verbessern. Zur Verbesserung des geschüttelten Repeated-batch-Systems wurde es mit elektrochemischen Sauerstoffsensoren ausgestattet. Die Messung des Sauerstoffpartialdrucks im Kopfraum der Reaktoren erlaubte die Kompensation der Sauerstoffpartialdruckabhängigkeit der Ethanolsensoren. Weiterhin konnte die Sauerstofftransferrate im Repeated-batch-Fermentationssystem während der Kultivierung bestimmt werden. Die Sauerstofftransferrate war mit 28 mmol/L/h in der gleichen Größenordnung wie bei der Batch-Kultivierung in der RAMOS-Anlage. Zur Online-Kalibrierung der Sauerstoffsensoren wurde eine Methode mittels Umstellen der Begasungsrate theoretisch betrachtet und praktisch implementiert. Nachdem die Essigfermentation im Millilitermaßstab in Schüttelkolben bewerkstelligt wurde, wurde sie auf den Mikrolitermaßstab in Mikrotiterplatten herunterskaliert. Um die Verdunstungsverluste von Ethanol und Essigsäure in einer Mikrotiterplatte während der Fermentation zu minimieren wurde ein maßgeschneiderter Deckel entwickelt. Für die Berechnung der Dimensionen eines Deckellochs, das eine ausreichende Belüftung und Sauerstoffversorgung garantiert, wurde ein Diffusionsmodell verwendet. Eine Referenzfermentation in einem 9 L-Bioreaktor diente der Auslegung geeigneter Kultivierungsbedingungen in der Mikrotiterplatte. Die minimalen Gelöstsauerstoffanteile in der Mikrotiterplatte lagen mit 7,5% bis 23% Luftsättigung in der gleichen Größenordnung wie im 9 L-Bioreaktor. Die Verdunstungsverluste von Ethanol und Essigsäure waren nach 47 h kleiner als 5% und damit im Vergleich zu einer Mikrotiterplattenfermentation mit einer gasdurchlässigen Folie deutlich reduziert. Die Kultivierungszeiten in der Mikrotiterplatte entsprachen mit 40 h der Kultivierungszeit im 9 L-Bioreaktor. Somit stellen Mikrotiterplattenkultivierungen mit dem maßgeschneiderten Deckel eine Plattform für Hochdurchsatzstudien an der Essigfermentation dar, die vergleichbare Ergebnisse zur Kultivierung im 9 L-Bioreaktor liefert.

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