Analyzing the fluxome of P. chrysogenum in an industrial environment : workflows for 13 C metabolic flux analysis in complex systems

  • Die Analyze des Fluxoms von P. chrysogenum in einem industriellem Umfeld : Workflows für die 13C metabolische Stoffflussanalyse in komplexen Systemen

Niedenführ, Sebastian; Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2014)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Kurzfassung

Metabolic Engineering ist eine gerichtete und wissensbasierte Methode, um die Produktionseigenschaften von Mikroorganismen zu verbessern. Sie zielt darauf ab, die Produktbildung der Mikroorganismen zu erhöhen, um ökonomische Produktionsprozesse zu schaffen. Das Fluxom, die Gesamtheit metabolischer Reaktionsraten, des Mikroorganismus wird durch mathematische Modellierung abgebildet. Das leistungsfähigste Werkzeuge der Fluxomanalyse, die 13C metabolische Stoffflussanalyse (13C-MFA), verwendet isotopisch markierte Substrate zur Kultivierung von Mikroorganismen. Die nach der Aufnahme und metabolischen Umsetzung entstehende Markierungsmuster in den Metaboliten werden durch hoch präzise Messapparate (zum Beispiel Massenspektrometer) quantifiziert. Aus diesen Messungen können die intrazellulären Reaktionsraten abgeschätzt werden. Die vorgelegte Arbeit befasst sich mit der 13C-MFA in komplexen Systemen. Dazu wurde P. chrysogenum BCB1 verwendet und unter industriellen Bedingungen die Bildung des Antibiotikums von Penicillin V untersucht. “Komplex” bezeichnet hier nicht nur das Wachstumsverhalten von P. chrysogenum, sondern auch die komplexe Nebenproduktbildung und Kompartimentierung des Metabolismus. Zudem zielt “komplex” auf die Übertragung der 13C-MFA von einer wissenschaftlichen Anwendung unter idealen Bedingungen zu einem industriellen Standard ab. Aus diesem Grund werden Voraussetzung und Annahmen für die Durchführung der Technik diskutiert und die notwendigen Anpassungen für den Einsatz im industriellen Umfeld beschrieben. Um gesicherte Erkenntnis über den Organismus zu erlangen, wird der Arbeitsablauf zur Durchführung der 13C-MFA vorgestellt. Durch die Untersuchungen werden die Defizite und Limitierungen der Technik aufgedeckt. Zuerst wurde die Technik in Chemostat Experimenten etabliert und auf Fed-batch Kultivierungen nahe am industriellen Prozess übertragen. Als Resultat liegen erstmals Stoffflusskarten unter diesen Prozessbedingungen vor. Die beiden Prozesse wurden mittels kinetischer Modellierung abgebildet um extrazelluläre Raten für die 13C-MFA abzuschätzen. Um die 13C-MFA anwenden zu können, mussten die zeitaufgelösten Markierungsanreicherungen extrapoliert und um die natürliche Markierung korrigiert werden. In der Arbeit wurden Toolboxen zur nichtlinearen Regression und globalen Sensitivitätsanalyse entwickelt. Großskalige metabolische Modelle wurden für P. chrysogenum aufgebaut, wobei experimentelle Daten und Datenbanken, sowie Literatur-Quellen, zum Einsatz kamen. Stammspezifische Messungen der Biomassezusammensetzung wurden in das Modell integriert. Um die Modelle auf ihre Anwendbarkeit zur Flussschätzung zu prüfen, wurde erstmals eine globale Sensitivitätsanalyse für die 13C-MFA durchgeführt. Zudem wurde diese Technik auf die zuvor beschriebenen Bioprozesse angewendet um die intrazellulären Reaktionsraten zu berechnen. Die erhaltenen, statistisch hochaufgelösten, Stoffflusskarten wurden weiter verbessert durch den Einsatz gezielter Versuchsplanung. Dazu wurden die konventionellen Versuchsplanungstechniken um die optimale Planung von sequentiellen Experimenten und Mehrzieloptimierung erweitert. Durch letzteres konnten optimale, und dennoch ökonomische, Versuche geplant und gleichzeitig die Nachteile konventioneller Techniken vermieden werden. Die Interpretation der generierten Stoffflusskarten zeigte, dass neben der Penicillinproduktion das Wachstum einen größeren Einfluss auf den oxidativen Pentosephosphatweg besitzt als bisher in der Literatur diskutiert. Dies führt zu einer sorgfältigen Ausbalancierung von Wachstum im Produktionsprozess und der gleichzeitigen Stammoptimierung.

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