Process Design Aspects for Small-Scale Fermentation Systems

Aachen / Publikationsserver der RWTH Aachen University (2015) [Doktorarbeit]

Seite(n): X, 106 S. : Ill., graph. Darst.

Kurzfassung

Filamentöse und biopolymerproduzierende Mikroorganismen gewinnen zunehmend an Bedeutung, da ihr Potential in Bezug auf weltweite Fragen der Nachhaltigkeit erkannt wurde. Ein ökonomisches industrielles Screening nach den besten mikrobiellen Produktionsstämmen und den geeignetsten Fermentationsbedingungen ist hierbei essentiell. Es ist bekannt, dass Filamente und Biopolymere die Viskosität von Fermentationslösungen beeinflussen, was zu einer Veränderung in der Sauerstoffversorgung der Mikroorgansimen führt. Der Einfluss der Viskosität auf den Sauerstofftransfer ist für viskose Fermentationen in Rührreaktoren gut dokumentiert. Über den gas/flüssig Sauerstofftransfer in viskosen Schüttelkolbenfermentationen ist allerdings sehr wenig bekannt. Gleichermaßen wurde auch die effektive Scherrate in Schüttelkolben bislang nicht systematisch untersucht, obwohl diese die vorherrschende Viskosität, das Mischen sowie den Massen- und Wärmetransport in viskosen Fermentationslösungen beeinflusst. Da unbekannte Sauerstofftransferraten und unbekannte effektive Scherraten das Risiko erhöhen, dass unter unvorteilhaften Bedingungen „gescreent“ oder produziert wird, wurden in dieser Arbeit vier Ziele verfolgt, die diese Wissenslücken adressieren.Erstens sollten Messungen und numerische Simulationen des Sauerstofftransfers in chemische und mikrobielle Modellflüssigkeiten durchgeführt und die Anwendbarkeit der weitverbreiteten Filmtheorie von Higbie untersucht werden. Hierbei wurde gezeigt, dass die Higbie’sche Filmtheorie nicht für Schüttelkolbenfermentationen mit einer Viskosität von bis zu 10 mPa·s anwendbar ist. Es konnte erstmalig beobachtet werden, dass sich die Sauerstofftransferkapazität OTRmax in Schüttelkolben – entgegen der Intuition – erhöht, wenn die Viskosität von 1 mPa·s auf 10 mPa·s steigt. Das ist gleichbedeutend mit einer verbesserten Sauerstoffversorgung für die Mikroorganismen. Des Weiteren wurde demonstriert, dass die OTRmax bei Viskositäten von bis zu 80 mPa·s kaum geringer ist als bei wasserähnlichen Viskositäten. Dies ist gegensätzlich zu Rührreaktoren, da sich die Sauerstoffversorgung hier auf bis zu 5% bei 80 mPa·s stetig verschlechtert. Zweitens sollte auf Basis des Buckingham’schen π-Theorems und experimenteller Daten eine erste Scherratenkorrelation für Schüttelkolben entwickelt werden, die für ein großes Spektrum an pseudo-plastischem Fließverhalten, Schüttelkolbengrößen und Schüttelbedingungen Gültigkeit besitzt. Es wurde festgestellt, dass Scherraten in Schüttelkolben unter üblichen Fermentationsbedingungen einen Bereich von 20 1/s bis 2000 1/s abdecken können. Die Anwendbarkeit der entwickelten Scherratenkorrelation wurde an drei verschiedenen Schüttelkolbenfermentationen demonstriert. Abhängig vom Fließverhalten der Fermentationsbrühe ist die effektive Scherrate im Kolben im Vergleich zu einem Rührreaktor mit gleichem Leistungseintrag mindestens 1.55 mal so groß. Dies kann bei üblichem Fließverhalten in einer bis zu 50% geringeren Viskosität im Schüttelkolben resultieren. Drittens sollte im Rahmen dieser Arbeit ein Mikrotiterplattenkonzept entwickelt werden, das das Überschwappen der rotierenden Flüssigkeit auch bei hohen Drehzahlen und Füllvolumina verhindert. Bislang sind geringe Füllvolumina pro Well erforderlich, um akzeptable Sauerstofftransferraten zu erzielen, was häufig im Gegeninteresse dazu steht, dass ausreichend Kulturflüssigkeit benötigt wird, um Offline-Analysen im Kontext eines Screening durchführen zu können. Mit einem Sulfit-System wurden erste Messungen der OTRmax in Prototypen des neuen Mikrotiterplattenkonzeptes durchgeführt und die erlangten Messdaten mit denen aus konventionellen Mikrotierplatten (MTP) verglichen. Hierbei konnte die vorteilhafte Anwendbarkeit des neuen Konzeptes für Bereiche, in denen konventionelle MTP überschwappen, klar aufgezeigt werden. Diese Bereiche hängen vom Plattenformat (96-well, 48-well oder 24-well) ab, da der Einfluss der Oberflächenspannung mit sinkendem Welldurchmesser steigt. Im Fall des 96-well Formates ist das neue Konzept gegenüber der konventionellen MTP nur bei sehr hohen Drehzahlen und großen Füllvolumina überlegen. Hingegen schwappen konventionelle 48-well MTP und 24-well MTP bereits bei moderaten Schüttelbedingen über, sodass das neue Konzept hier bereits bei geringeren Schüttelfrequenzen vorteilhaft ist. Um auch die Biokompatibilität sicherzustellen, wurde Escherichia coli zum direkten Vergleich im neuen Prototyp und in einer konventionellen MTP kultiviert. Neben der vorhandenen Biokompatibilität wurde hierbei außerdem gezeigt, dass Fermentationen im neuen Konzept durch das Erzielen höherer Sauerstofftransferraten verkürzt werden können. Zusammenfassend wurde also ein MTP-Konzept entwickelt, das sich besonders für Hochdurchsatzscreenings eignet, bei dem hohe Volumina an Überstand für Offline-Analysen benötigt werden. Viertens sollte ein Scale-down-Verfahren angewendet werden, das auf einem Sulfit-System basiert und zur Einstellung gleicher OTRmax-Werte in Mikrotiterplatten und Schüttelkolben geeignet ist. Generierte Sulfitdatensätze wurden verwendet, um Schüttelbedingungen zu identifizieren, die für den Modelorganismus Trichoderma reesei die gleiche Sauerstoffversorgung in Schüttelkolben und 24-well Mikrotiterplatten sicherstellen. In 24-well Mikrotiterplatten wurde die in einem industriellen Schüttelkolbenprotokoll erzielte OTRmax von 20 mmol/L/h mit folgenden Schüttelbedingungen erreicht: 1 mL Füllvolumen pro Well, 200 rpm Schüttelfrequenz und 50 mm Schütteldurchmesser. Mit diesen Schüttelbedingungen wurden nahezu identische Sauerstofftransferraten und Produktkonzentrationen in Schüttelkolben und 24-well Mikrotiterplatten als Funktion der Fermentationszeit gemessen. Das angewendete Sulfitverfahren stellt eine schnelle und genaue Möglichkeit dar, um durch das Scale-down eines etablierten Schüttelkolbenprotokolls in eine Mikrotiterplatte Hochdurchsatz zu erzielen. Die gewonnenen Erkenntnisse über den Sauerstofftransfer und die effektive Scherrate in viskosen Systemen sind wertvoll, um Unterschiede in Screening- und Produktionsergebnissen zu erklären. Konsistente Ergebnisse während verfahrenstechnisch fundierten Scale-up- und Scale-down-Prozessen ermöglichen schließlich eine ökonomische biotechnologische Prozessentwicklung.

Autorinnen und Autoren

Autorinnen und Autoren

Giese, Heiner

Gutachterinnen und Gutachter

Büchs, Jochen
Bardow, André

Identifikationsnummern

  • URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-007665
  • REPORT NUMBER: RWTH-2015-00766

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