In situ product recovery of antibodies with a reverse flow diafiltration membrane bioreactor

Meier, Kristina; Büchs, Jochen (Thesis advisor); Melin, Thomas (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2015)
Doktorarbeit

Kurzfassung

Die industrielle Herstellung von Massenprodukten erfolgt in vielen Branchen, wie beispielweise der Stahl-, Lebensmittel- oder petrochemischen Industrie, durch kontinuierliche Produktionsprozesse. Obwohl sie durch hohe Raum-Zeit-Ausbeuten, konstante Produktqualitäten sowie geringere Rüstzeiten überzeugen, konnten sich kontinuierliche Prozesse für die biotechnologische Produktion von Pharmazeutika bislang nur sehr vereinzelt durchsetzen. Dies ist vor allem in einer erhöhten Komplexität der Verfahrensführung, einer gesteigerten Kontaminationsgefahr sowie strikten Regularien begründet. Zudem wird in biotechnologischen Prozessen meistens eine zusätzliche Apparatur zum Rückhalt von Zellen benötigt, um die Produktausbeute zu steigern und somit wirtschaftlich kompetitiv zu sein. Eine Verfahrensausführung zur kontinuierlichen biotechnologischen Produktion mit integrierter Produktabtrennung ist die gepulste Diafiltration. Bei diesem membran-basierten Zellrückhaltesystem wird das Membranmodul in die Kultivierungsflüssigkeit des Bioreaktors getaucht. Folglich verbleiben die Zellen in ihrer optimalen Umgebung und sind daher nur minimalen Scherkräften und keinen zusätzlichen Limitationen ausgesetzt. Über die getauchte Membran wird abwechselnd Produktlösung gewonnen und Medium zugeführt, so dass die mögliche Bildung einer Deckschicht auf der Membran reduziert wird. Die Etablierung der gepulsten Diafiltration sowie ihre Modifikation für verschiedene Anwendungsbereiche ist Gegenstand dieser Arbeit. Zunächst wurde das Membranmodul der gepulsten Diafiltration bezüglich seiner Biokompatibilität untersucht. Da in der Literatur keine standardisierten Verfahren zur Untersuchung der Biokompatibilität von Kunststoffen beschrieben sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein solches Testverfahren entwickelt. Die Atmungsaktivität von Mikroorganismen wird bei diesem Biokompatibilitätstest in Abhängigkeit der Konzentration der verwendeten Kunststoffteile mittels der RAMOS Technologie (Respiration Activity Monitoring System) untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass 40 g L-1 Kabelbinder bzw. 4 – 10 g L-1 Polyamidschlauch inhibierend auf die Hefe Hansenula polymorpha wirken, da das toxische Monomer 1,8-Diazacyclo-tetradecane-2,7-dione bzw. der Weichmacher N-Butylbenzolsulfonamid aus den verwenden Kunststoffen auswäscht. Nach Gewährleistung der Biokompatibilität des Membranmoduls wurde die gepulste Diafiltration mit Fokus auf eine maximale Raum-Zeit-Ausbeute des Produktes sowie Langzeitstabilität des Filtrationsprozesses ausgelegt. Der gepulsten Diafiltration liegt eine Vier-Takt-Betriebsweise zugrunde, bei der zwischen Mediumszufuhr und Gewinnung der Produktlösung jeweils ein Zwischentakt zur Entleerung der Membran eingeführt worden ist. Durch gezielte Modifikation der Zwischentakte konnte verhindert werden, dass unverbrauchtes Medium in die Produktlösung gelangt. Das Resultat ist eine Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute sowie die Einsparung von Medium. Der Prozess gilt als langzeitstabil, wenn der kritische Flux, der zu einem Anstieg des Transmembrandrucks von 45 Pa min-1 führt, nicht überschritten wird. Mittels der Flux-Step Methode wurde der kritische Flux für die Kultivierung der Hefe H. polymorpha mit Syn6-Medium bzw. der tierischen Zelllinie CHO DG44 mit Power CHO 2 Medium zu 21 L m-2 h-1 bzw. 9 L m-2 h-1 bestimmt. Basierend auf diesen Daten wurde die benötige Membranfläche für eine langzeitstabile Anwendung beider Systeme abgeleitet. Eine erfolgreiche Demonstration der gepulsten Diafiltration ist sowohl für H. polymorpha, welche ein Antikörperfragment sezerniert, als auch für CHO Zellen, welche einen vollständigen Antikörper produzieren, in einen großen Durchflussratenbereich erfolgt. Im Vergleich zu einem konventionellen kontinuierlichen Prozess konnte die Antikörper-produktion mittels H. polymorpha verdreifacht werden. In diesem Versuch hat die Antikörpertransmission über 80% betragen und die Vitalität aller Zellen ist konstant größer als 85% gewesen. Die Anwendung der gepulsten Diafiltration für CHO Zellen erzielte Antikörpertransmissionen von 40 – 60%. Dies ist ein in der Literatur üblicher Wert für membranbasierte Zellrückhaltesysteme. Über 90% der CHO Zellen waren während der gesamten Anwendung der gepulsten Diafiltration vital. In beiden Fermentationen war der Transmembrandruck über einen Zeitraum von mehr als drei Wochen unkritisch, so dass die gepulste Diafiltration als langzeitstabiler, kontinuierlicher Prozesse betrachtet werden kann.Die Betriebsweise der gepulsten Diafiltration verursacht zeitlich heterogene Bedingungen, da Überschuss und Limitation der C-Quelle abwechselnd vorliegen. Dieser kurzzeitige Überschuss kann insbesondere bei Mikroorganismen im höheren Durchflussratenbereich zu kurzzeitigen Sauerstofflimitationen führen. Unter diesen Bedingungen produziert H. polymorpha Ethanol und die Produktausbeute wird verringert. Für die in dieser Arbeit untersuchten künstlich induzierten kurzzeitigen Sauerstofflimitationen hat die Konzentration des Antikörpers um 25% abgenommen. Eine sequentielle Verwendung von drei Membranen ermöglicht eine quasi kontinuierliche Medienzufuhr, so dass konstante und nahezu homogene Kultivierungsbedingungen ohne Bildung von Ethanol bei gleichbleibender Produkt-konzentration realisiert werden konnten. In dieser Arbeit hat sich die gepulste Diafiltration als robuster, langzeitstabiler und einfach umzusetzender Prozess zur in situ Produktgewinnung mit geringen Investmentkosten und minimalen Geräteaufwand erwiesen. Die Raum-Zeit-Ausbeute konnte deutlich gesteigert werden. Besonders vorteilhaft zeigte sich der Prozess bei scherempfindlichen Zellen und Organismen, welche Sauerstoff schnell verbrauchen.

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