Entwicklung einer modellbasierten Hochdurchsatztechnik zur Enzymcharakterisierung mit Schwerpunkt auf Langzeitstabilität

  • Development of a model based high throughput enzyme characterization technique with a focus on the long term stability

Rachinskiy, Kirill; Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2008)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Kurzfassung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine neuartige Apparatur „Enzymprüfstand“ entwickelt, welche die modellbasierte Charakterisierung von enzymatisch katalysierten Reaktionssystemen mit hohem Durchsatz ermöglicht. Somit lassen sich erstmals neben der bisher etablierten Enzymanfangsaktivität auch komplexere Prozesseigenschaften wie die Langzeitstabilität als Kriterium für die Enzymwahl in das Screening mit einbeziehen. Die Technik basiert auf der mathematischen Modellierung des Enzymverhaltens. Unterschiedliche Vorgänge, wie der Wechsel zwischen Faltungszuständen, die Enzymaktivierung und -deaktivierung werden als temperaturabhängige Reaktionen abgebildet. Dabei wird die unterschiedliche Geschwindigkeit der einzelnen Vorgänge berücksichtigt. So ist z.B. der Wechsel zwischen den Faltungszuständen so schnell, dass er im Rahmen des Messintervalls als temperaturabhängiges Gleichgewicht angesehen und als algebraische Gleichung modelliert wird. Die irreversiblen Deaktivierungseffekte können hingegen so langsam sein, dass sie erst auf der Zeitskala von Wochen oder Monaten sichtbar werden. Solche Effekte gilt es durch gezielte Temperaturführung in kurzen Experimenten zu beschleunigen und zu erfassen. Die modellbasierte Enzymcharakterisierung sieht die Temperatur als wichtigste Steuergröße in den Experimenten vor. Über die Systemantwort auf unterschiedliche Temperaturprofile wird das Modell des Enzymverhaltens identifiziert. Als Systemantwort dienen optische Signale, welche im direkten Zusammenhang mit der Produktbildung der enzymkatalysierten Reaktion stehen. In einem iterativen Vorgang werden Temperaturprofile entworfen, Experimente durchgeführt und Modellparameter geschätzt. Wird ein Modell identifiziert, welches in der Lage ist, das experimentelle Verhalten durch signifikante Parameter zu beschreiben und vorauszusagen, gilt das Stoffsystem als charakterisiert. Im Rahmen der Modellgültigkeit werden die Zielgrößen der Prozessentwicklung, wie z.B. die zeit- und temperaturabhängige Raum-Zeit-Ausbeute simuliert und optimiert. Somit besteht erstmals eine Methode, welche solche prozessrelevanten Größen als Screeningkriterien berücksichtigt. Apparativ ist der Enzymprüfstand in der Lage auf der Plattform einer 96-Well-Mikrotiterplatte die Steuergröße Temperatur zwischen 5 und 85°C mit einer Geschwindigkeit von +/-1°C/min mit einer Homogenität von +/-0,5°C zu regeln. Durch den Schüttelvorgang wird eine definierte Durchmischung erreicht. Bei sauerstoffverbrauchenden Reaktionen besteht die Möglichkeit einer definierten Begasung. Die Reaktionsüberwachung erfolgt online, nicht invasiv und ohne Unterbrechung des Schüttel- und des Temperiervorganges. Die fluoreszenzbasierte Messtech-nik ermöglicht eine flexible Verstellung der Anregungs- und Emissionswellenlängen im Bereich zwischen 200 und 750 nm während der Messung, sodass Intensitätswerte bei unterschiedlichen Wellenlängen oder auch Fluoreszenzspektren aufgenommen werden können. Die Versuchsführung erfolgt automatisiert. Die Charakterisierung des temperaturabhängigen Sauerstoffeintrages ist noch zu präzisieren. Im Rahmen der Arbeit wurden zwei Assays etabliert, welche bei sich ändernden Temperaturen für die Reaktionsdauer von bis zu ca. 10 h funktionieren. Ein Assay ist für jede pH-aktive Reaktion anwendbar. Er wurde am Beispiel einer Esterhydrolysereaktion etabliert. Der zweite Assay eignet sich für die Überwachung einer jeden sauerstoffverbrauchenden Reaktion. Er wurde an einem Laccase-Mediator-System und an einer Glucose-Oxidationsreaktion etabliert. Eine weitere vielversprechende optische Methode, die unterstützende Messung der Trp-Eigenfluoreszenz von Enzymen, wurde erfolgreich getestet und mit den Messungen der Reaktionsgeschwindigkeit korreliert. Ansätze für die Entwicklung weiterer universeller Assays wurden diskutiert. Das pH-aktive System und das sauerstoffverbrauchende System wurden beispielhaft am Enzymprüfstand charakterisiert. Die zeitliche und räumliche Extrapolierbarkeit der Modellvoraussage wurde für beide Systeme anhand von Langzeitmessungen gezeigt.

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