Model-based experimental analysis of enzyme kinetics in aqueous-organic biphasic systems

  • Modellgestützte experimentelle Analyse von Enzymkinetiken in wässrig-organischen Zweiphasensystemen

Zavrel, Michael; Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2009)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Kurzfassung

Die Immobilisierung von Biokatalysatoren in Hydrogelkugeln, die in einem organischen Lösungsmittel suspendiert werden, ist eine vielversprechende Methode zur Produktion hydrophober Feinchemikalien. Die rationale Entwicklung solcher Immobilisate wird jedoch aufgrund der Überlagerung von Stofftransfer, Diffusion und Enzymreaktion erschwert. Deshalb wurde ein mechanistisches Kinetikmodell entwickelt, das diese Phänomene quantitativ beschreibt. Als Beispiel wurde die stereoselektive Carboligation zweier 3,5-Dimethoxybenzaldehyd-Moleküle (DMBA) zu (R)-3,3',5,5'-Tetramethoxybenzoin (TMB) mit Hilfe des Enzyms Benzaldehydlyase (BAL) untersucht. Dabei wird die BAL in Kappa-Carrageenan-Hydrogelkugeln immobilisiert, welche von einem organischen Lösungsmittel umgeben sind. Zunächst wurden die Phänomene Enzymreaktion, Stofftransfer und Diffusion separat untersucht. Die dabei entwickelten Kinetikmodelle wurden schrittweise miteinander kombiniert und schließlich zu einem Gesamtmodell zusammengefasst. Zur Untersuchung jedes einzelnen Reaktionssystems wurde die modellgestützte experimentelle Analyse (MEXA-Methode) angewendet, die a priori Simulationen, Sensitivitätsanalysen und optimale Versuchsplanung einschließt. Damit wird nicht nur die Entwicklung mechanistischer Kinetikmodelle, sondern auch die Entwicklung optimaler Messmethoden und -techniken unterstützt. Mit Hilfe der MEXA-Methode konnten sowohl die kinetischen Parameter mit hoher Genauigkeit geschätzt, als auch neue mechanistische Kinetikmodelle entwickelt werden, die mögliche Limitationen und Engpässe aufdecken. Beispielsweise wurde die Freisetzung des Produktes als geschwindigkeitsbestimmender Schritt im Katalysemechanismus der BAL identifiziert, während die Anlagerung der Substrate den katalytischen Engpass bei der Benzoylformiatdecarboxylase (BFD) darstellt. Darüber hinaus wurde ein neuer Ansatz zur Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels entwickelt und angewendet. Dieser zeigte, dass Methylisobutylketon hohe Produktausbeuten für die untersuchte Carboligation ermöglicht. Schließlich wurde die Diffusion der Reaktanden im Hydrogel untersucht. Hierbei ergaben a priori Simulationen, dass der Kugelmittelpunkt den optimalen Messort darstellt. Zudem konnte gezeigt werden, dass das Diffusionsgesetz nach Nernst und Planck anstelle des Fick'schen Gesetzes für die Modellierung der Diffusion dissoziierender Stoffe wie Propionsäure in Hydrogelkugeln angewendet werden muss. Die Kopplung dieser einzelnen Systeme offenbarte, dass eine modellgestützte Versuchsplanung notwendig ist um Limitationen zu vermeiden. Zum Beispiel, sind in einem gerührten Zweiphasensystem die enzymkinetischen Parameter nur dann identifizierbar, wenn die Reaktion geschwindigkeitsbestimmend ist. Außerdem sind hierbei Messungen sowohl in der wässrigen als auch organischen Phase erforderlich. Das Emulgieren des Zweiphasensystems sollte vermieden werden, da hierbei die Bildung von Aggregaten beobachtet wurde, die auf eine Grenzflächeninaktivierung der Enzyme hindeutet. Zuletzt wurden die erhaltenen Parameterwerte für das Gesamtsystem und für die gekoppelten Systeme mit denen aus den einzelnen Stoffsystemen verglichen. Dabei konnten für die enzymkinetischen Parameter, sowie für die Partitionskoeffizienten und für den Diffusionskoeffizienten des Substrats keine signifikanten Abhängigkeiten von den jeweiligen Stoffsystemen festgestellt werden. Allerdings weisen die Stofftransportkoeffizienten und der Diffusionskoeffizient des Produkts für die verschiedenen Stoffsysteme deutliche Unterschiede auf. Aus diesem Grund müssen zur optimalen Gestaltung von Enzymimmobilisaten die Modellparameter am Gesamtsystem bestimmt werden, wohingegen die Verwendung der in den einzelnen Stoffsystemen separat bestimmten Parameterwerte zu Fehlern führen kann. Mit Hilfe des entwickelten mechanistischen Modells für das gelstabilisierte Zweiphasensystem können Limitierungen durch Diffusion und Stofftransfer erkannt werden. Somit stellt dieses den Grundstein für die modellgestützte Entwicklung von Enzymimmobilisaten dar und ermöglicht die Optimierung derartiger Prozesse. Zu diesem Zweck kann das Modell an andere Reaktionen, Biokatalysatoren, Lösungsmittel und Geometrien der Immobilisate angepasst werden. Die durch die mechanistische Modellierung identifizierten Engpässe im Katalysemechanismus der Enzyme BAL und BFD werden sicherlich zur Entwicklung neuer und aktiverer Enzymvarianten beitragen.

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