Single cell analysis of microbial production strains in microfluidic bioreactors

Jülich / Forschungszentrum Jülich, Zentralbibliothek (2015, 2016) [Buch, Doktorarbeit]

Kurzfassung

Seit Jahrzehnten werden mikrobielle Produktionsprozesse für die Umsetzung nachwachsender Rohstoffe zu industriell genutzten Grund- und Feinchemikalien verwendet. Das Auftreten von unterschiedlichen Subpopulationen (z.B. in Wachstum und Produktion) in mikrobiellen Produktionsprozessen kann einen signifikanten Einfluss auf Ertrag und Stabilität haben. Im Allgemeinen werden biologische Prozesse basierend auf Durchschnittswerten analysiert und optimiert. Hierbei bleibt jedoch das Verhalten einzelner Zellen unbeachtet, mit oftmals nicht abschätzbaren Folgen. Essentiell für die Wirtschaftlichkeit von etablierten als auch neuen Bioprozessen sind deshalb fundierte Kenntnisse bezüglich der Ursache und Ausmaßes von Populationsheterogenität, sowie den zugrunde liegenden molekularen Vorgängen. Die Forschung und Entwicklung im Bereich der mikrofluidischen Einzelzellanalysen hat in den letzten Jahren einen Aufschwung erlebt. Fortschritte in den Fabrikationsmethoden ermöglichen die Herstellung immer kleinerer Strukturen, selbst im Submikrometer-Bereich. Die Verwendung von mikrofluidischen Analysetechniken wie zum Beispiel mikrofluidischen Einzelzell-Bioreaktoren, ermöglicht die Untersuchung biologischer Prozesse auf Einzelzellebene. Im Gegensatz zu konventionellen Systemen, wie zum Beispiel der fluoreszenz-markierten Durchflusszytometrie, ermöglichen mikrofluidische Kultivierungssysteme die Analyse zellulärer Prozesse mit voller räumlicher und zeitlicher Auflösung. Die Kultivierung von Zellen in mikrofluidischen Bioreaktoren bietet zahlreiche Vorteile: Durch einen kontinuierlichen Medienfluss können die Kultivierungsbedingungen wie zum Beispiel Nährstoff- und Sauerstoffversorgung optimal eingestellt werden. Für die Charakterisierung und ein besseres Verständnis von mikrobiologischen Produktionsprozessen wurden diese Systeme bisher allerdings kaum herangezogen. In dieser Arbeit wurde die Herstellung, der Aufbau und die Verwendung von Einzelzell- Bioreaktoren für die Kultivierung von Bakterien untersucht. Um dieses Ziel zu erreichen wurden folgende Arbeitspakete durchgeführt: (i) Entwicklung von Einzelzell-Bioreaktoren für die Fixierung und die Kultivierung von Mikroorganismen; (ii) Etablierung eines Fertigungsprozesses für die Herstellung einer Abgussform; (iii) Abguss und Herstellung eines Polymer-Glas Chips; (iv) Aufbau der mikroskopischen Versuchseinheit für die Echtzeit-Beobachtung industriell genutzter Bakterienstämmen. Die Einzelzell-Bioreaktoren wurden für erste Wachstums- und Metabolismusstudien der industriell genutzten Bakterien Corynebacterium glutamicum und Escherichia coli genutzt. In diesem Kultivierungssystem wurden für C. glutamicum höhere Wachstumsraten im Vergleich zu konventionellen Kultivierungen gemessen. Weitere systematische Analysen beinhalteten sowohl Untersuchung von Wachstum und Morphologie einzelner Kolonien und Zellen bei verschiedenen Medienbedingungen, als auch die Untersuchung seltener zellulärer Ereignisse, wie dem Auftreten von spontan induzierter SOS Antwort von C. glutamicum. In einer Vergleichsstudie mit alternativ entwickelten Einzelzell-kultivierungssystemen (Agarose Pads und Dielektrophorese-Reaktoren) wurde der Einfluss der verschiedenen Kultivierungssysteme auf die Physiologie von C. glutamicum näher untersucht. Es konnten signifikanten Unterschiede bezüglich des Wachstumsverhaltens von C. glutamicum in den verschiedenen Systemen festgestellt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die unter mikrofluidischen Bedingen erzielten höheren Wachstumsraten von C. glutamicum näher untersucht. Systematische Untersuchungen in verschiedenen Kultivierungsmaßstäben (Pikoliter bis Liter) bestätigten die höheren Wachstumsraten im Pikoliter-Kultivierungsmaßstab. Durch detailliertere Studien in verschiedenen Kultivierungsmaßstäben sowie diverser gerichteter und ungerichteter Analyseverfahren konnte der Faktor gefunden werden, der für die höheren Wachstumsraten verantwortlich ist. Protocatechusäure, ursprünglich als Eisenchelator dem Medium zugesetzt, wird parallel zu Glukose als zusätzliche Kohlenstoffquelle verstoffwechselt. Erste Studien zeigen, dass auch in traditionellen Kultivierungssystemen eine höhere Wachstumsrate erreicht werden kann, solange dem Organismus Protocatechusäure in ausreichender Menge zur Verfügung steht. Zuletzt wird ein Ausblick über weitere Anwendungsmöglichkeiten der entwickelten Einzelzellsysteme gegeben. Die Flexibilität im Herstellungsprozess kann genutzt werden, um die vorgestellten mikrofluidischen Systeme der jeweiligen biologischen Fragestellung anzupassen. Dies erhöht nicht nur das Spektrum an Anwendungsmöglichkeiten, wie z.B. Langzeit-Wachstumsuntersuchungen, sondern ermöglicht auch die Untersuchung anderer biotechnologisch wichtiger Organismen wie z.B. Pilze und Hefen. Die Beispiele zeigen, dass mikrofluidische Einzelzell-Bioreaktoren nicht nur Einblicke in zelluläre Vorgänge ermöglichen, sondern auch das Potential bieten Bioprozesse nachhaltig zu verstehen und zu verbessern. In den folgenden Jahren gilt es nun die Systeme zu optimieren, zu charakterisieren, aber auch die Grenzen derartiger Systeme eingehend zu bewerten.

Autorinnen und Autoren

Autorinnen und Autoren

Grünberger, Alexander

Gutachterinnen und Gutachter

Wiechert, Wolfgang
Büchs, Jochen

Identifikationsnummern

  • ISBN: 978-3-95806-092-0
  • URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-059827
  • REPORT NUMBER: RWTH-2015-05982