Characterization of recombinant protein production in Escherichia coli and its influence on host cell metabolic activity

• Charakterisierung der rekombinanten Proteinproduktion in Escherichia coli und deren Einfluss auf die Stoffwechselaktivität des Wirts

Rahmen, Natalie; Büchs, Jochen (Thesis advisor); Jaeger, Karl-Erich (Thesis advisor)

Aachen (2016)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen, 2015

Kurzfassung

Biotechnologische Prozesse sind umweltfreundlich, haben im Vergleich zu konventionellen chemischen Verfahren gewöhnlich einen geringeren Ressourcen- und Energieverbrauch und sind deshalb wirtschaftlich realisierbar. So sind sie zunehmend von Bedeutung für die Herstellung industriell relevanter Produkte. Besonders die Produktion von Proteinen und Enzymen spielt eine wichtige Rolle, da diese vielfältige Anwendungsmöglichkeiten in der pharmazeutischen, Lebensmittel- und chemischen Industrie sowie der Medizin aufweisen. In Wissenschaft und Industrie wird häufig das Bakterium Escherichia coli für die biotechnologische Produktion rekombinanter Proteine eingesetzt, da es zum einen molekulargenetisch sehr gut charakterisiert ist und zum anderen eine Vielzahl an Expressionsvektoren und Wirtsstämmen zur Verfügung steht. Aufgrund der enormen Diversität der genetisch modifizierten Wirtsstämme ist die Auswahl eines geeigneten Stammes für die biotechnologische Produktion eines gewünschten rekombinanten Proteins jedoch häufig mühsam und zeitaufwendig. Ein wichtiger Aspekt bei der rekombinanten Proteinproduktion ist die sogenannte ‘metabolic burden’. Metabolic burden bezeichnet eine Belastung des mikrobiellen Stoffwechsels, die dadurch entsteht, dass Ressourcen und Energie, die dem Bakterium normalerweise für seinen eigenen Metabolismus zur Verfügung stehen, durch Plasmidreplikation, heterologe Genexpression und rekombinante Proteinproduktion entzogen werden. Dieser Material- und Energieentzug beeinträchtigt die Biomasseproduktion und Atmung des Wirtsorganismus. Das Vorkommen seltener Codons im heterologen Gen kann zu einer weiteren Beeinträchtigung der Proteinproduktion beitragen. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der rekombinanten Proteinproduktion in Escherichia coli und deren Einfluss auf die Stoffwechselaktivität des Wirtsorganismus. Dazu wurde zunächst ein einfacher Ansatz zur systematischen Charakterisierung industriell relevanter und der Identifizierung gut geeigneter T7-basierter E. coli Wirtsstämme für die rekombinante Proteinproduktion untersucht. Dabei wurde evaluiert, ob und inwieweit die Online-Messung der Atmungsaktivität zur Auswahl geeigneter Expressionsstämme geeignet ist. Die Sauerstofftransferrate (Oxygen Transfer Rate, OTR) wurde dabei mit Hilfe der RAMOS-Anlage (Respiration Activity MOnitoring System, RAMOS) bestimmt, um die metabolische Belastung des Wirts während der Produktion plasmidkodierter Proteine nachzuweisen. Sieben allgemein bekannte und häufig verwendete T7-basierte E. coli Wirtsstämme, welche die Gene für zwei rekombinante Proteine, eine Lipase des mesophilen Bakteriums Bacillus subtilis (BSLA) oder eine Oxidoreduktase des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus exprimieren, wurden während der Kultivierung unter nicht induzierenden und induzierenden Bedingungen verglichen.Zur weiteren Charakterisierung der rekombinanten Proteinproduktion in E. coli wurde der Einfluss kleiner Unterschiede in der heterologen lipA Gensequenz, welche für die BSLA codiert, auf die Stoffwechselaktivität des Wirtsorganismus untersucht. Dazu wurden solche E. coli BL21(DE3) Klone hinsichtlich ihrer metabolischen Aktivität analysiert, die kleine Unterschiede in der lipA Gensequenz tragen, die entweder zu einzelnen Codonaustauschen im Gen oder zu einzelnen Aminosäureaustauschen im Protein führen. Die Aminosäureaustausche waren dabei zufällig gewählt und über die gesamte Proteinsequenz der BSLA verteilt. Stille Mutationen innerhalb der für die BSLA kodierenden Sequenz wurden eingeführt, um an zwei zufällig definierten Positionen alle möglichen synonymen Arginin- und Leucincodons zu analysieren. Ferner wurden Klone untersucht, die identische Aminosäureaustausche unter Verwendung verschiedener synonymer Codons tragen. Die entsprechenden E. coli Klone wurden mit Hilfe spezialisierter Online- und Offline-Messtechniken während der Kultivierung in einem definierten Autoinduktionsmedium verglichen. Die RAMOS-Anlage wurde verwendet, um den metabolischen Zustand des rekombinanten Organismus quantitativ zu analysieren. Weiterhin wurden die Biomasse- und Proteinproduktion mit Hilfe des BioLector Systems bestimmt. Weitere Kultivierungsparameter, wie zum Beispiel die Verstoffwechslung der Kohlenstoffquellen oder die Plasmidkopienzahl wurden evaluiert, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen näher zu analysieren. In dieser Arbeit konnte zunächst gezeigt werden, dass die Online-Messung der Atmungsaktivität mittels RAMOS-Anlage eine einfache Abschätzung der rekombinanten Proteinproduktion ohne aufwendige Offline-Proteinbestimmung ermöglicht und so eine Identifikation geeigneter T7-basierter E. coli Wirtsstämme erlaubt. In Mineralmedium konnten unter IPTG- und Autoinduktion sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Korrelation zwischen der Atmungsaktivität und der Proteinproduktion für die untersuchten E. coli Stämme nachgewiesen werden. Unter den hier gewählten Bedingungen war E. coli BL21(DE3) der am besten geeignete Stamm für die rekombinante Produktion der BSLA mittels IPTG- und Autoinduktion. Die kleinen Modifikationen innerhalb der lipA Gensequenz führten zu starken, sehr reproduzierbaren Unterschieden in Atmungsaktivität, Biomasse- und Zielproteinproduktion. Eine quantitative Evaluation der Atmungsaktivität ermöglichte die Klassifizierung aller untersuchten Klone in zwei verschiedene Typen: Typ A und Typ B. Weiterhin konnten unter Berücksichtigung der Atmungsaktivität fünf charakteristische Kultivierungsphasen identifiziert werden, die zum einen Informationen über die sequentielle Verstoffwechslung der verschiedenen Kohlenstoffquellen liefern, zum anderen Aufschluss darüber geben, in welchen Phasen der Kultivierung Biomasse oder Protein gebildet wird. Tendenziell zeigten Typ A Klone eine höhere Produktbildung, Typ B Klone hingegen eine stärkere Biomasseproduktion. Um ein tieferes Verständnis der phänomenologischen Unterschiede zwischen den beiden Typen A und B zu erhalten, wurde eine Reihe potentieller Faktoren untersucht, welche eine Ursache für die zwei Verhaltensmuster der Atmungsaktivität darstellen könnten. Die Verfügbarkeit intrazellulärer Nukleobasen sowie Codon Usage, metabolische Kosten für die Aminosäurebiosynthese, Enzymaktivität, die Bildung von Einschlusskörperchen (inclusion bodies) oder das Verhältnis von unlöslichem zu löslichem Protein zeigten hier jedoch weder einen Einfluss auf heterologe Genexpression und rekombinante Proteinproduktion noch waren sie Ursache für die Unterschiede zwischen Typ A und Typ B Klonen. Dennoch konnte gezeigt werden, dass die kleinen Unterschiede innerhalb der heterologen lipA Gensequenz ein reduziertes initiales Wachstum der Typ B Klone verursachten, welches wiederum zu einer geringeren Biomassekonzentration zum Induktionszeitpunkt führte. In der Folge waren die Plasmidkopienzahl und das Expressionslevel geringer als bei den Typ A Klonen und die Verstoffwechslung der Kohlenstoffquellen Lactose und Glycerin änderte sich. Obwohl die zugrundeliegenden molekularen Ursachen noch nicht identifiziert sind, konnte in dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass kleinste Änderungen in der Sequenz eines heterologen Genes, die lediglich zu einzelnen Aminosäure- oder Codonaustauschen führen, immense Auswirkungen auf den Metabolismus des Wirtsorganismus und die rekombinante Proteinproduktion haben. In Zukunft kann dies enorme Auswirkungen auf die Codon-Optimierung heterologer Gene, die Screening-Prozesse nach verbesserten Enyzmvarianten sowie die Prozesse zur biotechnologischen Proteinproduktion haben.