A new method to quantify the CO 2 sensitivity of micro-organisms in shaken bioreactors and scale up to stirred tank fermentors

• Eine neue Methode zur Quantifizierung der CO2 Empfindlichkeit von Mikro-Organismen in geschüttelten Bioreaktoren und deren Scale-Up auf gerührte Fermentatoren

Amoabediny, Ghassem; Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2006)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Kurzfassung

Geschüttelte Bioreaktoren im kleinen Maßstab (z.B. Schüttel-Kolben), üblicherweise mit verschiedenen Arten von Steril-Verschlüssen ausgestattet, sind sehr nützliche Werkzeuge in der Biotechnologie. Der Gas-Transfer-Koeffizient der Steril-Verschlüsse spielt eine wichtige Rolle in der Belüftung der geschüttelten Bioreaktoren. Die Größe von hängt vom durchschnittlichen Diffusions-Koeffizienten des Sauerstoffs , von den verschiedenen Längen und/oder auch vom Durchmesser des Kolben-Halses ab. Aus diesem Grund wurden für diese Studie mit Watte versehene Röhrchen verschiedener Längen und / oder Durchmesser für einen speziellen Schüttel-Kolben, einem so genannten Ventilations-Kolben, eingesetzt. Der Gas-Transfer durch den Steril-Verschluss wurde charakterisiert. In allen Ventilations-Kolben wurden konstante Werte für die jeweiligen CO2 und O2 Diffusions-Koeffizienten nachgewiesen. Unter Zuhilfenahme dieser Werte und der Geometrie der Kolbenhälse konnte ein breites Spektrum von Werten für in den Ventilations-Kolben hergeleitet werden. Da bei abnehmendem eine Reduzierung der O2-Konzentration bei gleichzeitiger Akkumulation von CO2 in der Gasphase der geschüttelten Bioreaktoren einhergeht, ist ein gutes Verständnis ebenso wie realistische Einschätzungen den Gas-Transfer in geschüttelten Bioreaktoren betreffend von Vorteil, um eventuell auftretende Sauerstoff-Limitation bzw. Kohlendioxid-Inhibition der Mikroben-Kultur vermeiden zu können. In dieser Studie wurde ein Gas-Transfer-Modell unter unsteady-state Bedingungen für Schüttel-Kolben entwickelt und dieses experimentell für ein breites Spektrum von Gas-Transfer-Koeffizienten untersucht. Die angewendete Herangehensweise basiert auf dem Modell von Henzler und Schedel [23], welches die örtlich veränderlichen Gas-Partial-Drücke innerhalb des Steril-Verschlusses unter Einfluss der lokalen Gas-Diffusions-Koeffizienten und des konvektiven Stefan-Flow’s beschreibt. Zur weiteren einfachen Bearbeitung wird der resultierende Gesamt-Massen-Transfer-Koeffizient als Funktion des Sauerstofftransfers durch den Steril-Verschluss durch eine empirische Gleichung beschrieben. Diese Gleichung wird in ein Simulations-Modell eingeführt, das die Gas-Partial-Drücke im Kopf-Bereich des Kolbens berechnet. Zudem werden die Gas-Transfer-Raten durch den Steril-Verschluss und die Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche innerhalb des Kolbens angegeben. Simulationen deuten darauf hin, dass die Vernachlässigung des Sauerstoff-Gehalts im Kopf-Bereich des Kolbens unter Anfangsbedingungen (einfache steady-state-Annahme) zu einer Unterschätzung des Sauerstoff-Transfers in die flüssige Phase führt. Das Ausmaß des Fehlers hängt von den jeweiligen Bedingungen ab. Eine gute Übereinstimmung des eingeführten unsteady-state-Modells mit den experimentellen Ergebnissen für das Sulfit und das biologische System bestätigten die Validität und die Nützlichkeit der vorgeschlagenen unsteady-state Herangehensweise. Darüber hinaus wurde eine neue und einfache Methode zur Quantifizierung der CO2-Empfindlichkeit von Mikro-Organismen in Ventilations-Kolben (unter Benutzung deren Eigenschaften) untersucht. Die Unterschiede zwischen den Werten von akkumuliertem CO2 und der Sauerstoff-Konzentration in einer Ventilations-Kolben-Kultur bestätigten die Validität der Methode. Die Auswirkung von Belüftung auf die Abfuhr von CO2 aus der Fermentations-Brühe wurde dokumentiert. Zudem wurde die neue Methode, basierend auf Daten der Oxygen Transfer Rate (OTR), welche mit Hilfe eines RAMOS-Systems (Respiratory Activity Monitoring System) bei verschiedenen Belüftungs-Raten aufgenommen wurde, als eine Online-Überwachungs-Methode für die CO2-Empfindlichkeit von Mikroorganismen in geschüttelten Bioreaktoren entwickelt. Ein maximaler Wert von 12% für die akkumulierten CO2 -Konzentrationen wurde in beiden o.g. Methoden hergeleitet, vorausgesetzt, dass das Kultivierungs-System unter optimalen Bedingungen ausgeführt wurde (z.B. das selbe Füllvolumen (15ml), angemessene Medien- und Puffer-Kapazitäten zur pH-Kontrolle, der geeignete OTR-Wert (0,05), Betrieb unter nicht vorhandener Sauerstoff-Limitation und RQ 1). Die geeigneten Betriebs-Bedingungen konnten unter Nutzung des unsteady-state-Modells vorhergesagt werden. Unter Anwendung der erwähnten Methoden konnte ein signifikanter Einfluss des akkumulierten CO2 auf die Biomasse-Konzentration, Wachstumsrate und Lysin-Produktion der Fermentation mit C. glutamicum DM 1730 nachgewiesen werden. Des Weiteren wiesen die experimentellen Ergebnisse bei Arxula adeninivorans LS3 und Hansenula polymorpha (WT ATCC 34438 und RB11-FMD-GFP) darauf hin, dass das CO2 keinen Einfluss auf diese Mikroorganismen hatte. Pseudomonas fluorescens DSM 50090 auf Hefe-Extrakt + Glucose und Corynebacterium glutamicum ATCC WT13032 auf L-Lactat reagierten sehr empfindlich auf CO2, was gut mit Literatur-Werten übereinstimmt. Einige der wichtigen Vorteile der neuen Methoden umschließen Einfachheit, geringere Kosten und Zeitaufwand, einfache Handhabung und das Erhalten von Resultaten, welche mit Fermentationen im großen Maßstab vergleichbar sind. Außerdem wurde eine neue Belüftungs-Strategie, ausgehend von den Ventilations-Kolben, hin zu einem belüfteten Fermentations-System (z.B. durch Messung im Kolben und im gerührten Fermenter) entwickelt, basierend auf denselben Gas-Konzentrationen (O2 und CO2) im Kopf-Raum dieser Behälter. Unter Anwendung dieser Methode konnten die Konzentrationen von CO2 und O2 in der Gasphase, welche in (belüfteten) Kolben und gerührten Bioreaktoren gemessen wurden, mit denen verglichen werden, die in den Ventilations-Kolben nachgewiesen worden sind. Schließlich wurde noch in dieser Studie eine neue Scale-Up Methode von Schüttelkolben zu gerührten Fermentern, im Hinblick auf die Auswirkungen von CO2-Ventilation, die Belüftungs-Strategie betreffend, untersucht. Selbst bei grundauf verschiedenen Belüftungs-Einstellungen wurden ähnliche Tendenzen für Biomasse-Konzentration, L-Lysin-Produktion, maximalem OTR und spezifischer Wachstumsrate bei der Fermentation des Modell-Organismus C. glutamicum DM1730 für beide Maßstäbe nachgewiesen. Folglich konnte die Möglichkeit einer Maßstabs-Vergrößerung von Ventilations-Kolben hin zu gerührten Bioreaktoren, basierend auf dem Kriterium der CO2-Ventilation, demonstriert werden.

Einrichtungen

• Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik [416510]
• Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik [416510]