Entwicklung und Anwendung einer Fed-batch-Betriebsweise mit Nährstofffreisetzungssystemen zur kontrollierten Kultivierung und zum Screening von Mikroorganismen in Schüttelreaktoren

  • Development and application of a fed-batch mode with nutrient release systems for controlled cultivation and screening of microorganisms in shaken bioreactors

Jeude, Markus; Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2007)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Kurzfassung

Die meisten industriellen Produktionsprozesse werden im Fed-batch-Verfahren betrieben. Im Gegensatz dazu wird das Selektionsverfahren der mikrobiellen Produktionssysteme im Batch-Betrieb durchgeführt. Dabei herrschen völlig andere physiologische Bedingungen als jene, die für ein Produktionsverfahren relevant sind. Es kann daher zu einer falschen Stammauswahl kommen. Um dieses Problem zu lösen, wurden Silicondisks mit eingelagerten Glucosekristallen entwickelt. Ein Fed-batch-Verfahren mit Diffusion von Glucose aus Silicondisks wurde in Schüttelreaktoren realisiert. Diese „Slow-release Fed-batch-Technik“ wurde am Stoffwechsel von H. polymorpha, E. coli und G. oxydans in Schüttelkolben getestet. Die OTR und der RQ wurden mit einer RAMOS-Anlage online aufgezeichnet. Biomassebildung, Synthese von GFP oder eYFP-IL-6, pH-Drift und die metabolische Dynamik von Glucose, Ethanol, Essigsäure und weiteren organischen Säuren wurden offline gemessen. Mit der Slow-release Fed-batch-Technik konnte der Overflow-Metabolismus bei H. polymorpha und E. coli im Vergleich zum Batch-Betrieb reduziert werden, was zu einer Erhöhung der Biomasseausbeute um bis zu 85% bzw. 59% führte. Bisher wurden 23,4 g/L Biotrockenmasse von H. polymorpha und 13,7 g/L E. coli erreicht. Die spezifischen Biomasseausbeuten von 0,38-0,47 liegen in der gleichen Größenordnung wie diejenigen von Laborfermentern mit einer Substratfütterpumpe. Die GFP-Expression durch H. polymorpha RB11 pC10-GFP konnte bis zu 35-fach in Syn6-MES- und 420-fach in YNB-Mineralmedium gesteigert werden. Im Fed-batch-Betrieb wurden bisher maximal 421 mg/L GFP synthetisiert. Im Gegensatz dazu wurden nur bis 2,5 mg/L GFP im Batch-Betrieb erhalten. Die Expression des Fusionsproteins, bestehend aus „stark gelb fluoreszierendem Protein und Interleukin-6 (eYFP-IL-6)“, durch E. coli BL21 pLys pRSET eYFP-IL6 konnte 4-fach in optimiertem Wilms-MOPS-Mineralmedium gesteigert werden. Bei Kultivierungen von G. oxydans DSM 2003 wurde im Vergleich zum Batch-Verfahren eine Erhöhung der spezifischen Biomasseausbeute um den Faktor 2,6 in Silberbach-MES-Komplexmedium erreicht. Es wurden im Gegensatz zu 1,6 g/L im Batch-Betrieb 3,3 g/L Biotrockenmasse erhalten. Durch Glucosefütterung wurde eine Reduktion der Bildung von Gluconsäure und 2- und 5-Ketogluconsäure bewirkt. Ein Massen-Screening wurde mit 265 H. polymorpha RB11 pC10-FMD und 267 pC10-MOX Klonen in Syn6-MES-Mineralmedium durchgeführt. Pro Klon wurden je eine Batch-Fermentation mit Glucose, eine mit Glycerin und eine Slow-release Fed-batch-Fermentation mit Glucose inokuliert. Das Screening wurde einmal wiederholt. Bei den verschiedenen Betriebsweisen resultierten grundlegende Unterschiede bezüglich Stammauswahl und Quantität der spezifischen GFP-Ausbeute. Es ist unwahrscheinlich, dass die besten Stämme für einen Fed-batch-Prozess im Batch-Screening gefunden werden. Ebenso wurde eine Abhängigkeit des regulierenden Promotors bei der Genexpression von der Art der Kohlenstoffquelle und der Betriebsweise entdeckt. Ein Fed-batch-Screening erweist sich folglich als sicherste Methode, um den richtigen Stamm für einen Fed-batch-Prozess zu identifizieren.

Identifikationsnummern