Online monitoring in continuously shaken microtiter plates for scalable upstream bioprocessing

Kensy, Frank Torsten; Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2011)
Doktorarbeit

Kurzfassung

Diese Dissertation untersucht die Anwendungsmöglichkeiten von Mikrotiterplatten als Hochdurchsatz-Experimentierplattform in der Bioprozeßentwicklung. Zu diesem Zwecke wurden drei grundlegende Aspekte der Fermentation in dieser Arbeit studiert: 1) Charakterisierung von Stofftransfer-Bedingungen in Mikrotiterplatten (MTPs), 2) Entwicklung einer neuen Online-Meßtechnik zur Detektion relevanter Fermentationsparameter, 3) Überprüfung der Skalierbarkeit von Mikrotiterplatten auf Rührkessel-Fermenter. Der Sauerstofftransfer in Mikrotiterplatten wurde mit Hilfe der Sulfit-Oxidationsmethode in 24-, 48- and 96-Well MTPs ausführlich charakterisiert. Einerseits stellte sich dabei heraus, dass die erreichten Sauerstofftransfer-Kapazitäten (OTRmax) von 0,039 and 0,052 mol/L/h (kLa= 250 and 300 1/h) für runde 24- und 96-Well MTPs für die meisten mikrobiellen Fermentationen limitierend sein können. Andererseits zeigten runde 48-Well MTPs sehr hohe OTRmax-Werte von 0,28 mol/L/h (kLa= 1600 1/h), jedoch mit dem Nachteil, dass diese hohen Stofftransferwerte nur bei sehr hohen Schüttelfrequenzen (1400 1/h) und sehr kleinen Füllvolumina (300µL) erreichbar waren. Bei diesen Bedingungen fällt das Online-Monitoring in den Wells der MTP und die Probennahme für Offline-Analytik schwer. Daher wurde auch die neu entwickelte 48-Well Flowerplate eingesetzt. Die Sauerstofftransfer-Kapazität (OTRmax) konnte auf 0,14 mol/L/h (kLa= 800 1/h) bei akzeptablen Füllvolumina (500 µL) bestimmt werden. Zudem ist das Online-Monitoring und die Probennahme aus den Wells bei diesen Bedingungen möglich. Des Weiteren wurde eine neue Online-Meßtechnik für die Detektion aller relevanter Fermentationsparameter wie Biomasse- und Proteinkonzentration von fluoreszierenden Proteinen sowie pH und pO2 mit Hilfe der Optoden-Technologie entwickelt. Diese mittlerweile unter dem Markennamen “BioLector” kommerzialisierte Technologie detektiert die genannten Parameter online in allen Wells einer Mikrotiterplatte während des kontinuierlichen Schüttelvorgangs eines Rotationsschüttlers. Die neue Technik wurde anhand von verschiedenen mikrobiellen Fermentationen mit dem Bakterium Eschericha coli und der Hefe Hansenula polymorpha validiert. Es konnte eine sehr weite lineare Korrelation zwischen Biomassetrockensubstanz (bis zu 50 g/L) und dem online detektierten Streulicht für Bakterien und Hefen aufzeigt werden. Die Skalierbarkeit zwischen Mikrotiterplatten- und Rührkessel-Fermentationen konnte für Eschericha coli und Hansenula polymorpha bewiesen werden. Der Vergleich von Mikrotiterplatten-Fermentationen mit 200 µL und Rührkessel-Fermentationen mit 1,4 L zeigten die gleiche Fermentationskinetik und –zeiten sowie gleiche absolute Konzentrationen für Biomasse und exprimiertes Protein (hier das Model-Protein: Green Fluorescent Protein) in beiden Maßstäben. Die Kombination der neuen Online-Meßtechnik mit der erst kürzlich entwickelten Flowerplate zeigte abschließend die großen Anwendungsmöglichkeiten in der Bioprozeßentwicklung. Die Technologie erfüllt alle Anforderungen an einen idealen Mikrobioreaktor: Hochdurchsatz, hohe Prozeß-Information und Skalierbarkeit auf Standard-Rührkessel-Fermenter. Die Anwendung dieser neuen Technology in der Bioprozeßentwicklung verspricht eine drastische Vereinfachung und Beschleunigung der Stammselektion und der Fermentationsentwicklung durch die Generierung von mehr relevanten Bioprozeß-Informationen im Mikromaßstab.