Optimizing microbial screenings using controlled-release systems

Scheidle, Marco; Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2011)
Doktorarbeit

Kurzfassung

Mikrobielle Screeningexperimente sind von großer Bedeutung für die Entwicklung biotechnologischer Prozesse, u.a. zur Auswahl des geeignetsten Mikroorganismus. Die Kultivierungsbedingungen in solchen Versuchen sollten den Bedingungen eines nachfolgenden Produktionsprozesses so gut wie möglich entsprechen. Dabei ist es absolut notwendig, vergleichbare Kultivierungsbedingungen in Kleinkulturscreenings und im großen Produktionsmaßstab zu verwenden, um sowohl eine aussagekräftige Analyse der Screeningexperimente treffen zu können, als auch ein erfolgreiches Scale-up zu realisieren. In dieser Arbeit werden verschiedene Facetten von Screeningexperimenten analysiert und Lösungen für die Optimierung in Hinsicht auf die vorher genannten, generellen Prinzipien untersucht. Ein zentraler Punkt zur Verbesserung der Vergleichbarkeit von Screeningexperimenten und Versuchen im Produktionsmaßstab ist, eine online Überwachung von Kultivierungsparametern sowohl im großen, als auch im kleinen Maßstab zu etablieren. Zur Weiterentwicklung der online im Schüttelkolben gemessenen Parameter während des Screenings und der Prozessentwicklung, wurden das „Respiration Activity Monitoring System“ (RAMOS) zur Messung von Atmungsaktivitäten und eine optische online pH-Messtechnik erfolgreich kombiniert. Zur Verbesserung der Vergleichbarkeit der verschiedenen Maßstäbe und um zuverlässiges Scale-up zu ermöglichen, müssen die Kultivierungsstrategien (z.B. der Verlauf der pH-Werte und der Substratkonzentrationen während der Kultivierung) im kleinen und im großen Maßstab vergleichbar sein. Aus diesen Gründen müssen die im großen Maßstab verwendete pH-Regelung und die Fed-batch-Betriebsweise für Screeningexperimente etabliert werden. Ein scheibenförmiges, polymerbasiertes Freisetzungssystem zur pH-Kontrolle in Schüttelkolben wurde in dieser Arbeit vorgestellt und verwendet. Es besteht aus einer Polymermatrix, in die Natriumcarbonat als pH-Stellmittel eingebettet wurde. Wird es im Kultivierungsmedium verwendet, setzt es das Natriumcarbonat in einer bestimmten Kinetik frei. Mit Hilfe dieses Freisetzungssystems war es möglich, die Pufferkonzentrationen in Escherichia coli Schüttelkolbenkultivierungen drastisch zu reduzieren. Dabei konnten die pH-Werte in einem Bereich gehalten werden, welcher für die Mikroorganismen physiologisch verträglich ist. Die pH-Werte in Kultivierungsmedien haben einen starken physiologischen Einfluss auf das mikrobielle Wachstum von Mikroorganismen, wobei insbesondere die Länge der Lag-Phase beeinflusst wird. Unterschiedliche Lagzeiten von Mikroorganismen haben wesentliche Auswirkungen auf die Ergebnisse von Screeningexperimenten. In dieser Arbeit wird demonstriert, dass Start-pH-Werte von Kultivierungsmedien enorme, stammspezifische Effekte auf die Lagzeit von E. coli Kulturen aufweisen. Für drei verschiedene E. coli Stämme konnte eine verkürzte Lagzeit bei niedrigeren Start-pH-Werten und für einen weiteren Stamm das gegenteilige Verhalten nachgewiesen werden. Dieser Parameter sollte daher bei der Auslegung von Produktionsprozessen, als auch von Screeningexperimenten berücksichtigt werde. Ein anderer analysierter Aspekt von Screeningexperimenten war das mikrobielle Wachstum von Vorkulturen. Es konnte demonstriert werden, dass Unterschiede im Inoculum von Vorkulturen in geschüttelten Bioreaktoren einen sehr großen Einfluss auf das Wachstum von Mikroorganismen haben und damit das rationale Design von Screeningprozessen maßgeblich beeinflussen. Aus diesem Grund wurde eine neue Technik zur Hochdurchsatz fed-batch Kultivierung von Vorkulturen präsentiert, mit der die Startparameter anschließender Screeningexperimente entsprechend angepasst werden können. Für die fed-batch Kultivierung in Schüttelkolben wurden glukosehaltige, polymerbasierte Freisetzungsscheiben verwendet. Für Anwendungen im Hochdurchsatz wurde eine neue Fed-batch-Mirkrotiterplatte vorgestellt, die am Boden von jedem Well ein immobilisiertes, polymerbasiertes Freisetzungssystem enthält. Diese neu entwickelte Methode zur fed-batch Vorkultivierung erlaubt das Angleichen des Wachstums aller gescreenten Stämme und generiert dadurch zuverlässigere Daten im anschließenden Screeningexperiment. Die erfolgreiche Anwendung dieser neuen Methode für die Vorkultivierung von E. coli und Hansenula polymorpha wird in dieser Arbeit dargestellt. Die vorgestellten Ergebnisse demonstrieren, wie wichtig eine sorgfältige Auswahl der Kultivierungsparameter für ein erfolgreiches mikrobielles Screening ist. Insbesondere die Kontrolle des pH-Wertes und die kontrollierte Freisetzung von Substraten sind relevant für verschiedene Aspekte von Screeningexperimenten. Die in dieser Arbeit entwickelten Systeme und Methoden verbessern signifikant das Screening von Mikroorganismen und ermöglichen ein sinnvolles Scale-up in den Produktionsmaßstab.

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