Microfluidic bioprocess control in baffled microtiter plates

Funke, Matthias; Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2011)
Doktorarbeit

Kurzfassung

Die Effektivität eines biotechnologischen Produktionsprozesses wird maßgeblich durch die Auswahl (screening) geeigneter Biokatalysatoren sowie die Charakterisierung der optimalen Betriebsbedingungen bestimmt. Hierfür ist eine Vielzahl von Experimenten (high-throughput screening) notwendig, was allerdings einer zügigen Bioprozessentwicklung oftmals entgegensteht. Das in dieser Arbeit entwickelte Mikrofermentationssystem auf Basis von Mikrotiterplatten (MTPen) soll zur Lösung dieses Widerspruchs beitragen. Basis des Systems ist die BioLector-Technologie. Dieses faseroptische Meßsystem ermöglicht die Online-Erfassung wichtiger Fermentationsparameter in jeder Kavität einer MTP. Um ihre Anwendung als Mikrofermenter weiter zu verbessern, wurden die Stofftransfereigenschaften in MTPen durch das Einbringen von Stromstörern optimiert und eine aktive Prozesskontrolle mittels mikrofluidischer Bauteile integriert. Moderne Screeninguntersuchungen werden bevorzugt in MTPen durchgeführt, obwohl die für diese Anwendungen bislang nicht optimiert wurden. Ein Nachteil bei ihrer Anwendung ist der geringe Sauerstoffeintrag ins Kulturmedium. Eine prinzipielle Lösung dieses Problems besteht im Einbringen von Stromstörern in die einzelnen Kavitäten der MTP. Um den Einfluss von Stromstörern auf Sauerstofftransfer und Hydrodynamik der rotierenden Flüssigkeit detailliert zu untersuchen, wurden in der hier vorgestellten Arbeit 30 verschiedene Stromstörergeometrien in die Kavitäten einer 48-Well MTP integriert. Es konnte gezeigt werden, dass damit die Sauerstofftransferkapazität (OTRmax) auf einen Wert von mehr als 100 mmol/L/h (kLa > 600 1/h) verdoppelt werden kann. Gleichzeitig konnte die Steighöhe der rotierenden Flüssigkeit reduziert und somit das anwendbare Kulturvolumen maximiert werden. Die dadurch gesteigerte Flüssigkeitsmenge am Boden der Kavität ermöglichte zusätzlich eine Verbesserung der Messwertaufnahme durch den BioLector. Als Optimum wurde eine Kavitätengeometrie identifiziert, die sechs halbkreisförmige Ausstülpungen aufweist und in ihrer Form an eine Blumenblüte erinnert. Bislang war die systematische Beschreibung und Standardisierung von Stromstörern geschüttelter Bioreaktoren nicht möglich. In der hier vorgestellten Arbeit konnte jedoch eine Beziehung zwischen dem OTRmax sowie der Steighöhe der rotierenden Flüssigkeit zum Umfang der Querschnittsfläche der Kavitäten aufgestellt werden. Diese Beziehung erlaubt erstmals die systematische Beschreibung der beobachteten Stromstöreffekte und die Definition eines „Bewehrungsgrades“ geschüttelter Bioreaktoren. Weiterhin konnte ein Maximum des Bewehrungsgrades identifiziert werden, welches nicht überschritten werden sollte, um eine gleichmäßige Flüssigkeitsbewegung und einen hohen Sauerstoffeintrag zu gewährleisten. Dieses Konzept kann in Zukunft zur Auslegung neuer Stromstörer dienen. Im Produktionsmaßstab werden biotechnologische Prozesse zumeist unter Kontrolle des pH Wertes und unter Zufuhr von Substratlösungen (fed-batch) durchgeführt. In MTPen jedoch, kann im Normalfall auf solche aktive Prozesskontrolle nicht zurückgegriffen werden, da diese zumeist auf komplexe Hardware angewiesen ist. Die daraus folgende Beschränkung auf einfache, diskontinuierliche (batch) Prozesse kann die Maßstabsübertragung (scale-up) des Bioprozesses beeinträchtigen. Um der Diskrepanz zwischen den Kultivierungsmaßstäben entgegenzuwirken, wurde in dieser Arbeit die BioLector-Messtechnologie mit mikrofluidischer Prozesskontrolle in MTPen kombiniert. Zusammen mit dem Institut für Werkstoffe der Elektrotechnik 1 der RWTH Aachen wurde hierfür ein Konzept entwickelt, bei dem Mikrofluidikbauteile den Boden konventioneller MTPen ersetzen. In pH kontrollierten sowie in Fed Batch Fermentationen mit Escherichia coli wurde die Funktionsfähigkeit dieser Technologie nachgewiesen. Außerdem konnte das Scale-Up dieser Mikrofermentationen in den Maßstab eines 1 L Laborfermenters erfolgreich realisiert werden. Spezielles Augenmerk wurde bei der Konzeptentwicklung auf die Anwenderfreundlichkeit des Systems gelegt. Um diese zu gewährleisten wurden Einweg-Mikrofluidikbauteile sowie eine benutzerfreundliche Steuerungshardware entwickelt. Das in dieser Arbeit vorgestellte Mikrofermentationssystem kombiniert verschiedene Vorteile: (1) verbessertes Reaktordesign durch die Verwendung von MTPen mit Stromstörern; (2) mikrofluidische Prozesskontrolle in Einweg-Kulturgefäßen; (3) benutzerfreundliche Steuerungs- und Messhardware; (4) umfassende Online-Überwachung der Fermentationsparameter. Die Zusammenführung dieser Vorteile erlaubt die Nutzung von Einweg-MTPen mit Mikrofluidik in einem Mikrofermentationssystem, welches auch für den Routineeinsatz im Laboralltag geeignet ist. Diese Technologie ermöglicht die Durchführung skalierbarer, umfassend geregelter und überwachter Fermentationen im Mikrolitermaßstab. Damit wird es möglich, die Effizienz von Screening und Bioprozessentwicklung zu steigern.