A fundamental research of growth, metabolism and product formation of tobacco suspension cells at different scales

Ullisch, David; Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2012)
Doktorarbeit

Kurzfassung

Seit mehr als zwanzig Jahren spielen Pflanzenzellkulturen (PZK) eine große Rolle bei der Expression von rekombinanten Proteinen wie Hormonen, Wachstumsfaktoren, Antikörpern und Antigenen. Bisher lagern alleine mehr als 700 verschiedene Arten von PZK in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig. Die Tabakzelllinie Nicotiana tabacum BY-2 spielt hier eine besondere Rolle, da sie als Modelorganismus für die Untersuchung von PZK dient. Zur Charakterisierung dieser Zelllinie wurden in bisherigen Studien oft nur ein oder zwei Wachstumsparameter (Biomasse, Leitfähigkeit, oder Osmolalität) herangezogen. Folglich kann man nur einen eingeschränkten Einblick in den Stoffwechsel der PZK bekommen. Ein erstes Ziel dieser Arbeit ist die Identifikation der optimalen Wachstumsbedingungen in Schüttelkolben sowie eine umfassende Charakterisierung einer transgenen Tabakzelllinie. Für diese Charakterisierung wurde online die Sauerstofftransferrate dieser Zelllinie mit Hilfe des Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS) und überdies eine Vielzahl verschiedener Wachstumsparamter offline bestimmt. Eine höhere Schüttelfrequenz resultierte in höheren Sauerstofftransferraten und in einem schnelleren Wachstum. Darüber hinaus konnte online der Verbrauch von Ammonium im Medium anhand der Sauerstofftransferrate abgeleitet werden. Das MS-medium das bevorzugte Medium für die Kultivierung von Tabaksuspensionszellen. Basierend auf einer umfassenden Analyse des MS-Mediums sowie Zusammenhängen zwischen Wachstum und rekombinanter Proteinexpression wurde das MS-Medium gezielt optimiert. In dieser Arbeit dienten die Fluoreszenzproteine GFP und YFP als Modelproteine. Es wurde gezeigt, dass die Anfangskonzentration von Ammonium einen signifikanten Einfluss auf das Zellwachstum und die Proteinsynthese hat. Nach einer gezielten Optimierung des MS-Mediums konnte die Menge des Zielproteins verdoppelt werden. Das optimierte MS-Medium zeigte auch bei einer anderen transgenen Tabakzelllinie (NT-1) den gewünschten Effekt und verdoppelte die Endkonzentration des therapeutisch wichtigen Proteins Hämaggluthinin A (HA) des Vogelgrippevirus. Eine Routinemethode zur Handhabung von PZK ist die sogenannte Subkultivierung bei der durchwachsene Zellkultur in frisches Medium pipettiert wird. Allerdings kommt es bei Anwendung dieser Methode zu undefinierten Animpfbedingungen. Aus diesem Grund werden zur Produktion von rekombinanten Proteinen tierische Zellkulturen bevorzugt, da für diese bereits ein Zellbanksystem etabliert ist. Darüber hinaus spielt die genetische Instabilität von transgenen PZK eine große Rolle, denn es kommt häufig zu einer inkonsistenten Expression des Zielproteins. Dieses bekannte Problem wurde bislang kaum dokumentiert. In dieser Arbeit wurde diese Variabilität im Wachstum anhand von insgesamt 22 Sauerstofftransferraten aus einem Zeitraum von über 2 Jahren dargestellt. Mit Hilfe einer neuen Methode der Subkultivierung konnten reproduzierbarere Ergebnisse erzielt werden. Die Produktivität sank in diesem Zeitraum um ca. 80%. Außer in Schüttelkolben wurden PZK auch in Mikrotiterplatten (MTP) sowie in Rührkesselreaktoren kultiviert. In dieser Arbeit wurde ein Scale-up, basierend auf einem gleichen volumetrischen Leistungseintrag durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die steigende Viskosität ein Schlüsselparameter für das Wachstum im Fermenter darstellt. In MTP wurde die Expression von GFP das erste Mal online mit Hilfe des BioLectors gemessen. Es wurde gezeigt, dass das optimierte MS-Medium auch zu einem höheren GFP-Signal in MTP geführt hat. Die vorliegende Arbeit liefert einen tiefen Einblick in den Stoffwechsel und die Kultivierung von Tabaksupensionszellen in Schüttelkolben, Rührkesselreaktoren und MTP. Durch eine Kombination aus dem online Signal der Sauerstofftransferrate und mit Hilfe einer Vielzahl verschiedener Offlineparamter konnte das MS-Medium gezielt optimiert werden und die Ausbeute des Zielproteins letztendlich verdoppelt werden. Mit Hilfe der RAMOS-Technologie ist es möglich die Sauerstofftransferrate von PZK online zu messen. Damit ist sie ein wichtiges analytisches Werkzeug bei der Untersuchung weiterer Zelllinien und deren Optimierung von Kultivierungsbedingungen.

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