Determination of intrinsic enzyme reaction kinetics using thermodynamic activities

Grosch, Jan-Hendrik; Spieß, Antje (Thesis advisor); Büchs, Jochen (Thesis advisor); Pohl, Martina (Thesis advisor)

Aachen (2016)
Doktorarbeit

Kurzfassung

Bei der Entwicklung wettbewerbsfähiger biokatalytischer Reaktionssysteme ist die Auswahl geeigneter Lösungsmittel besonders wichtig. Bislang beruht diese Auswahl zumeist auf dem Prinzip von Versuch und Irrtum, da die im Verlauf der Reaktion zu Grunde liegenden thermodynamischen Phänomene und kinetischen Effekte zumeist unbekannt sind. Um eine rationale Auswahl des Reaktionsmediums zu ermöglichen, müssen sie identifiziert und charakterisiert werden. Die Effekte können unterteilt werden in (I) Veränderungen der thermodynamischen Aktivitäten der Reaktanden und in (II) Änderungen der intrinsischen Reaktionsparameter. Ziel dieser Arbeit ist es, mittels kinetischer und thermodynamischer Modellierung beide Effekte am Beispiel der für Oxidoreduktasen voneinander zu trennen, um so eine Identifizierung der intrinsischen kinetischen Parameter in einphasigen wassermischbaren Lösemitteln zu erlauben. Die Arbeit kann dabei in drei Aspekte unterteilt werden:Als erstes werden die Carbonylreduktase aus Candida parapsilos (CPCR2) und die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis (LbADH) als mögliche Modellenzyme untersucht und quantitativ charakterisiert. Hierzu werden Inaktivierungsphänomene wie Oxidation, Dissoziation, Scherkräfte und Adsorption an Grenzflächen im Mikroliter-Maßstab anhand kinetischer Analysen untersucht und quantifiziert. Für die CPCR2 wird eine komplexe Enzyminaktivierung beobachtet, die primär durch Grenzflächeneffekte und Dimerdissoziation gekennzeichnet ist. Für die LbADH wird nur bei geringer Proteinkonzentration eine Tetramerdissoziation beobachtet, die mathematisch sehr gut durch eine Zerfallsgleichung erster Ordnung beschrieben werden kann.Als zweites wird die Belastbarkeit der kinetischen Experimente im Mikroliter-Maßstab in Küvetten und Mikrotiterplatten (MTP) untersucht. Bei der Verwendung von MTP häufig auftretende Probleme wie ungleichmäßige Temperatur- und Verdunstungsprofile werden evaluiert. Der Temperaturgradient innerhalb einer MTP beträgt bis zu 2,2 °C. Die hierdurch hervorgerufene Abweichung der Enzymaktivität beläuft sich auf bis zu 20% innerhalb einer MTP und auf 40% im Verhältnis zu Messungen in Küvetten. Die beobachteten Anfangsgeschwindigkeiten zeigen einen systematischen Anstieg von Polystyrol- zu Quartz-MTP und Quartz-Küvetten, wobei der bestimmte experimentelle Fehler in eben dieser Reihenfolge sinkt (18 auf 2%). Während sich die bestimmten mikrokinetischen Parameter für die einzelnen experimentellen Systeme um Größenordnungen unterscheiden können, unterscheiden sich die berechneten makrokinetischen Parameter zwischen den Systemen um höchstens den Faktor 2 bis 3. Als drittes wurde MTBE als Modell-Lösemittel eingesetzt, da es sowohl gute Enzymstabilitäten als auch eine Veränderung der thermodynamischen Aktivitäten, die mittels COSMO-RS berechnet wurden, zeigt. Kinetische Versuche bei identischen und gezielt unterschiedlichen thermodynamischen Aktivitäten der Reaktanden wurden für die Schätzung mechanistischer Parameter genutzt. Obwohl mittels konzentrationsbasierter Schätzung ein positiver MTBE Einfluss auf die Reaktion bestimmt werden konnte, zeigen die thermodynamisch korrigierten kinetischen Daten einen negativen Effekt steigender MTBE-Konzentrationen auf das Enzym. Damit konnten erfolgreich Rückschlüsse auf die Wechselwirkung zwischen Lösemittel und Enzym gezogen werden.Im Rahmen dieser Arbeit wird die Bedeutung einer rationalen Analyse und eines grundlegenden Verständnisses des experimentellen Systems in der Biokatalyse deutlich. Erfolgreich wurde die Trennung von intrinsischen Kinetiken und thermodynamischen Effekten gezeigt. Dies ermöglicht in Zukunft ein tiefergehendes Verständnis des Verhaltens von Biokatalysatoren in organischen Lösungsmitteln. Die Wechselwirkungen zwischen Lösungsmittel und Enzym können damit weiter beleuchtet werden, womit sich ein Weg zur rationalen Auswahl des Reaktionsmediums bietet.