Technical developments for online bioprocess monitoring in continuously orbitally shaken microtiter plates

Aachen (2017) [Doktorarbeit]

Seite(n): 1 Online-Ressource (XV, 107 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Kurzfassung

In der Biotechnologie sind geschüttelte Bioreaktoren weit verbreitet. Insbesondere Mikrotiterplatten werden immer häufiger als Bioreaktoren in frühen Stadien der Prozessentwicklung eingesetzt. Mit Mikrotiterplatten basierten Kultursystemen können zahlreiche Versuche parallel und binnen kurzer Zeit durchgeführt werden. Zusätzlich werden aufgrund des reduzierten Materialeinsatzes Kosten eingespart. Als Bioreaktor werden Mikrotiterplatten heute weitestgehend in Kombination mit orbital rotierenden Schüttelmaschinen eingesetzt. Aufgrund der orbitalen Schüttelbewegung wirkt die Zentrifugalkraft auf die Kulturbrühe, was zur Ausbildung einer rotierenden Flüssigkeitssichel führt. Neben einer Durchmischung der Kulturbrühe bewirkt dies auch eine Vergrößerung der Gas-Flüssigkeits-Austauschfläche, welche wiederum die Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen begünstigt.Das Potential solcher Kleinkultursysteme wird jedoch erst ausgeschöpft, wenn auch eine Überwachung der ablaufenden Reaktionen in den einzelnen Bioreaktoren (möglichst in Echtzeit) erfolgt. Mit Hilfe der BioLector Technologie, welche auf der optischen Prozessüberwachung mittels Fluoreszenz und Lichtrückstreuung basiert, werden bereits zahlreiche Prozessparameter wie die Biomasse, NADH oder Flavin während der Kultivierung in orbital geschüttelten Mikrotiterplatten verfolgt. Weitere wichtige biotechnologische Prozessparameter wie der pH-Wert und die Gelöstsauerstoffkonzentration (DOT) können jedoch nicht direkt über Fluoreszenz bestimmen werden. Zur deren Bestimmung können prinzipiell aber Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden, die ihr Fluoreszenzverhalten in Abhängigkeit der jeweiligen Konzentrationen ändern. Bislang ist es üblich, die sensitiven Fluoreszenzfarbstoffe in Mikrotiterplatten auf dem Wellboden zu immobilisieren. Diese optischen Sensorspots werden auch als Optoden bezeichnet. In der Literatur wurde jedoch aufgezeigt, dass Interferenzen zwischen biogener Fluoreszenz und dem Fluoreszenzfarbstoff auftreten können, die dann fehlerhafte Messergebnisse generieren.In der vorliegenden Arbeit wird ein alternatives, ebenfalls auf einem Fluoreszenzfarbstoff basierendes Messsystem zur Überwachung der DOT in orbital geschüttelten Mikrotiterplatten vorgestellt. Der sensitive Fluoreszenzfarbstoff wird mit rotem Licht angeregt. Zur Bestimmung der DOT wird das emittierte Licht im Nah-Infrarotbereich gemessen. Als Rohsignal wird bei dieser Methode die Fluoreszenzlebensdauer ausgewertet. Der Messbereich liegt außerhalb des Bereichs biogener Fluoreszenz. Interferenzen mit dem Messsystem treten daher nicht auf. Ein weiterer Vorteil dieses Messsystems besteht darin, dass der verwendete Fluoreszenzfarbstoff an Nanopartikeln immobilisiert ist, die einfach der Kulturbrühe zugegeben werden können. Entsprechend kann das Messsystem mit beliebigen Mikrotiterplatten verwendet werden und eine Abhängigkeit von Optoden ist nicht länger gegeben. Diese DOT-Messtechnik wurde in einem BioLector integriert und erfolgreich zur Überwachung mikrobieller Systemen eingesetzt. Es wurde gezeigt, dass die dispergierten sauerstoffsensitiven Nanopartikel das Wachstumsverhalten von Gluconobacter oxydans, Hansenula polymorpha und Escherichia coli nicht beeinflussen.Ein BioLector, ausgestattet mit der oben beschriebenen alternativen DOT-Messtechnik, wurde in der vorliegenden Arbeit zusätzlich mit der sogenannten µRAMOS Technik kombiniert. µRAMOS ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung der Sauerstofftransferrate (OTR) in jedem einzelnen Well einer 48-Well-Mikrotiterplatte. Da sowohl die BioLector Technologie als auch die µRAMOS Technik auf optischen Messsignalen basiert, wurde ein Messzyklus vonnöten, der eine interferenzfreie Messung sicherstellt. Mit dem neu entwickelten Versuchsaufbau werden in einem einzigen Versuch erstmals gleichzeitig Daten gewonnen, die in der Vergangenheit lediglich aus der Kombination von aufwendigen parallel durchgeführten Schüttelkolben- und Mikrotiterplattenexperimenten erhalten werden konnten. Durch die Kombination beider Messsysteme wurde es zudem möglich, den volumetrischen Sauerstofftransferkoeffizienten (kLa) während E. coli Kultivierungen zu bestimmen. Die hier bestimmten kLa-Werte stimmen sehr gut mit einer aus der Literatur bekannten empirischen Korrelation überein.Ähnlich der DOT, können noch weitere wichtige Prozessparameter nicht direkt mittels Fluoreszenz bestimmt werden. So sind beispielsweise die in vielen Kulturmedien enthaltenen Kohlenstoffquellen Glukose und Glycerin nicht fluoreszenzaktiv. Für diese Substanzen sind bisher jedoch keine selektiven Fluoreszenzfarbstoffe bekannt. Um diese Prozessgrößen dennoch nichtinvasiv bestimmen zu können, kann aber auf die sogenannte 2D-Fluoreszenzspektroskopie zurückgegriffen werden. Bei der 2D-Fluoreszenzspektroskopie werden mehrere Anregungs- und Emissionsspektren einer Probe aufgenommen und als Anregung vs. Emission Matrix (2D-Fluoreszenzspektrum) zusammengefasst. Zur Auswertung der während der Kultivierung aufgenommenen 2D-Fluoreszenzspektren und der damit verbundenen großen Datenmengen müssen chemometrische Methoden wie die „Partial Least Squares" (PLS) Regression verwendet werden. Dieses Vorgehen wurde bisher lediglich in Rührkesselreaktoren (mit einem Arbeitsvolumen > 1 L) realisiert, da mit gewöhnlichen Fluoreszenzspektrometern bisher keine ausreichend hohe Aufnahmerate zur gleichzeitigen Überwachung aller Wells in Mikrotiterplatten erzielt werden konnte. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses Messprinzip erstmals auf Mikrotiterplatten übertragen. Zur Realisierung einer ausreichend hohen Aufnahmerate wurde eine Spektrometer, basierend auf einer „Charge Coupled Device“ (CCD) Kamera in einen BioLector, integriert, wodurch komplette Emissionsspektren auf einmal aufgenommen werden können. Um zuverlässige Messungen zu gewährleisten wurde eine umdrehungsaufgelöste Messung etabliert. In Kultivierungen von H. polymorpha und E. coli wurden die Anwendbarkeit des Systems zur Bestimmung der Konzentrationen von Glukose, Glycerin und Acetat sowie dem pH-Wert über die Zeit demonstriert.Die in dieser Arbeit entwickelten Überwachungstechniken für Kleinkultursysteme, ermöglichen nun den Zugriff auf Prozessparameter die bisher nicht einfach und zuverlässig bestimmt werden konnten. Die neu entwickelten Systeme gestatten dem Anwender einen wesentlich tieferen Einblick in die untersuchten Kultivierungen. Die klare Trennung zwischen sekundärem Screening und Prozessentwicklung verschwimmt damit zusehends.

Autorinnen und Autoren

Autorinnen und Autoren

Ladner, Tobias Michael David

Gutachterinnen und Gutachter

Büchs, Jochen
Hitzmann, Bernd

Identifikationsnummern

  • URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2017-011808
  • REPORT NUMBER: RWTH-2017-01180