Optical online oxygen monitoring of aerobic cultivations in shake flasks and microtiter plates

Aachen (2017) [Doktorarbeit]

Seite(n): 1 Online-Ressource (XIV, 88 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Kurzfassung

Zwei der wichtigsten Prozessparameter für aerobe Kultivierungen von Mikroorgansimen oder Zellen sind der Sauerstoffverbrauch und -gehalt innerhalb der Kulturflüssigkeit. Anhand des Verbrauchs lassen sich beispielsweise Massenbilanzen und Stöchiometrien aufstellen und anhand des Gehalts lässt sich unter anderem eindeutig das Vorliegen einer Sauerstofflimitierung aufdecken. Der zeitliche Verlauf dieser Parameter kann zusätzlich als charakteristischer, physiologischer Fingerabdruck einer aeroben Kultur angesehen werden. Beide Größen ermöglichen eine aussagekräftige Prozesscharakterisierung und -überwachung. Aufgrund dessen werden entsprechende Sonden und Analytiken im Fermentermaßstab standardmäßig eingesetzt. Die ersten Schritte einer Prozessentwicklung werden jedoch nicht im Fermenter, sondern typischerweise im Kleinkulturmaßstab durchgeführt. Standard Kulturgefäße sind dort der klassische Schüttelkolben oder die immer häufiger eingesetzte Mikrotiterplatte. Die geringeren untersuchten Probenvolumina und eine parallele Versuchsdurchführung mehrerer Experimente spart Zeit, senkt den Ressourcenverbrauch und somit die Kosten. Aufgrund der geringeren Dimensionen lassen sich allerdings nicht ohne weiteres die Messtechniken vom Fermenter- auf den Kleinkulturmaßstab übertragen. Um bereits in frühen Phasen der Prozessentwicklung fundierte Kenntnisse zu erlangen, ist es von generellem Interesse neue Messtechniken für den Kleinkulturmaßstab zu entwickeln und bereits bestehende Technologien zu verbessern. Innerhalb dieser Arbeit wurden deshalb drei verschiedene Methoden zur online-Überwachung von Kulturen im Kleinkulturmaßstab entwickelt, vorgestellt und charakterisiert. Zunächst erfolgte die Realisierung einer Analytik zur online-Messung der Sauerstoffsättigung (DOT) einer Schüttelkolbenkultur. Durch die Verwendung von sauerstoff-sensitiven Nanopartikeln wurde ein einfach anzuwendendes, robustes und verlässliches Messsystem geschaffen, welches bei vielen Kultivierungsbedingungen und komplexen sowie synthetischen Medien eingesetzt werden kann. Bei einer Zugabe von 0.1 g L 1 sauerstoff-sensitiver Nanopartikel waren aussagekräftige DOT Messungen möglich. Die Biokompatibilität der verwendeten sauerstoff-sensitiven Nanopartikel konnte für H. polymorpha, X. campestris and E. coli durch RAMOS-Kultivierungen gezeigt werden. Des Weiteren wurde die Wichtigkeit einer notwendigen Kalibrierung unter Kultivierungsbedingungen demonstriert. Die Autoklavierbarkeit der verwendeten sauerstoff-sensitiven Nanopartikel wurde gezeigt und ist ein großer Vorteil für sterile Kultivierungen. Das vorgestellte Schüttelkolben Messsystem zeigte sich insgesamt als wertvolle Alternative für bestehende Verfahren, besonders bei geringen Füllvolumina und hohen Schüttelfrequenzen. In Kombination mit RAMOS Daten war es möglich den kLa Wert online während Kultivierungen von K. lactis, E. coli and H. polymorpha zu bestimmen. Die ermittelten kLa Werte waren in guter Übereinstimmung mit einer bereits veröffentlichten empirischen Korrelation basierend auf der Osmolarität des Mediums.Darauf aufbauend erfolgte die Übertragung dieser Messtechnik auf den Mikrotiterplatten Standard in Kombination mit der BioLector Technologie. Die entsprechende Faser der Sauerstoff-Sensorik wurde mit Hilfe der BioLector Verfahreinheit unterhalb der Mikrotiterplatte verfahren. Durch die dispergierten sauerstoff-sensitiven Nanopartikel war eine nicht-invasive online Messung der Sauerstoffsättigung durch den transparenten Wellboden robust, verlässlich und automatisiert möglich. Durch den Verzicht auf immobilisierten Sensor-Optoden auf den Wellböden lässt sich dieses Messverfahren auf beliebige Mikrotiterplatten mit transparentem Boden ausweiten. Zusätzlich ergab sich ein wirtschaftlicher Vorteil gegenüber etablierten Systemen. Des Weiteren konnte das System zur Berechnung von Sauerstofftransferraten auf Basis der gemessenen DOT Werte genutzt werden. Die berechneten und die mit Hilfe der RAMOS Technologie gemessenen OTR Werte im Schüttelkolben zeigten eine gute Übereinstimmung.Als drittes Messsystem erfolgte die Realisierung einer mikrotiterplatten-basierten und well-aufgelösten µRAMOS Anlage zur Messung der Sauerstofftransferrate. Auf Basis eines ersten 4-Well Prototypen entstand ein zweiter überarbeiteter 48-Well-Prototyp. Die notwendige Sensor und Ventiltechnik konnte dabei in einer mikrofluidischen Mikrotiterplattenabdeckung integriert werden. Der Vergleich zur etablierten RAMOS Kolbenanlage erfolgte anhand von vier Beispielkulturen und zeigte eine vergleichbare Qualität der ermittelten Sauerstofftransferraten. Der Versuchsdurchsatz konnte somit verglichen mit der etablierten 8-Kolbenanlage signifikant um den Faktor 6 auf 48 mögliche parallele Kultivierungen erhöht werden. Der Medieneinsatz wurde von typischerweise 10 mL im Kolben auf 800 µL in der Mikrotiterplatte um den Faktor 12,5 pro Kultivierung verringert.Zusammenfassend wurden drei Messsysteme erfolgreich entwickelt, realisiert und charakterisiert, die eine online Bestimmung der Sauerstoffsättigung bzw. der Sauerstofftransferrate ermöglichen und somit für einen Einsatz als aussagekräftige online Analytiken in der Prozessentwicklung im Kleinkulturmaßstab prädestiniert sind.

Autorinnen und Autoren

Autorinnen und Autoren

Flitsch, David Matthias

Gutachterinnen und Gutachter

Büchs, Jochen
Klimant, Ingo

Identifikationsnummern

  • REPORT NUMBER: RWTH-2017-03395