Light-mediated control and analysis of recombinant protein production in microscale cultivations

Wandrey, Georg Benjamin; Büchs, Jochen (Thesis advisor); Pietruszka, Jörg (Thesis advisor)

Aachen (2017)
Doktorarbeit

Kurzfassung

Die effiziente Herstellung technischer oder pharmazeutischer Proteine erfordert während der Prozessentwicklung eine hohe Anzahl an Kultivierungsexperimenten. Diese werden im Kleinkulturmaßstab häufig parallelisiert durchgeführt und können mit Hilfe von etablierter Messtechnik überwacht werden. Eingriffsmöglichkeiten in den Prozess stehen in diesem Maßstab jedoch nur in begrenztem Umfang zur Verfügung. Ziel dieser Arbeit ist es daher, Licht, das bisher für nicht-invasive Messungen eingesetzt wird, auch für die Reaktivierung von mit photolabilen Schutzgruppen versehenen Induktoren einzusetzen und miniaturisierte Kultivierungen somit optisch zu steuern.Ausgehend von der etablierten BioLector-Technik wird dazu zunächst ein Screeningsystem mit optischer Onlinemesstechnik konstruiert. Die Demonstration der Leistungsfähigkeit des Geräts erfolgt am Beispiel einer Optimierung des positionsgenauen Einbaus von nicht-natürlichen Aminosäuren in rekombinante Proteine für Click-Chemie-Anwendungen. Insbesondere durch eine massive Erhöhung der Aminosäurekonzentration wird eine mehr als siebenfache Zielproteinkonzentration erreicht. Um eine optische Steuerung im Mikrotiterplattenmaßstab zu ermöglichen wird das Messsystem mit einem neu entwickelten UV-A-LED-Modul erweitert, mit dem jedes Well einer 48-Well-Mikrotiterplatte individuell und intensiv belichtet werden kann. Am Beispiel eines mit 6-Nitropiperonal geschützten Derivats des Induktors Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wird gezeigt, dass eine minimal-invasive optische Induktion erreicht werden kann und dass diese die konvenionelle Induktion vollständig ersetzten kann.Über einen Ersatz von konventionellen Methoden hinaus bietet das optische Verfahren auch neue Eingriffsoptionen. Am Beispiel von NVOC-Methionin wird gezeigt, dass die Bildung eines Fluoreszenzproteins in einem methioninreprimierbaren S. cerevisiae-Stamm mit komplexen Belichtungsprofilen wahlweise gestartet, pausiert oder gestoppt werden kann. In Kombination mit den Onlinesignalen des BioLectors wird ein geschlossener Regelkreis aufgebaut. Auf diese Weise kann die Bildung von rekombinanten Proteinen in parallelisierten Kultivierungen sowohl optisch gemessen als auch geregelt werden, was eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten in der biotechnologischen Prozessentwicklung eröffnet.

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