Robotic high-throughput screening for the optimization and prediction of recombinant protein expression in microscale

Aachen (2018, 2019) [Doktorarbeit]

Seite(n): 1 Online-Ressource (XII, 123 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Kurzfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurden sowohl Methoden für ein reproduzierbares Klonscreening, als auch Methoden zur Erhöhung und Vorhersage der rekombinanten Proteinproduktion in Escherichia coli entwickelt. Automatisierte Hochdurchsatzscreenings mit kombinierbaren Modulen aus Upstream- und Downstreamprozessen konnten realisiert werden. Dabei wurde sowohl nach optimierten Stämmen gescreent, als auch nach optimierten Kultivierungs- und Induktionsbedingungen. Als Basis diente eine Roboterplattform (RoboLector), die neben einem Liquid Handling Systemzusätzlich mit einem BioLector ausgestattet ist. Standardprozeduren für die manuelle Medienpräparation, Zelllyse, Proteinquantifizierung, Detektion von Enzymaktivität und Probenahme wurden auf automatisierbare Protokolle transferiert. Viele Parameter beeinflussen die rekombinante Proteinexpression. In dieser Arbeit wurden die Temperatur, die Induktorkonzentration und der Induktionszeitpunkt genauer untersucht. Mithilfe des RoboLectors wurden Induktionsprofile in 48-Well Flowerplates erstellt und zudem mit Schüttelkolben Experimenten in der RAMOS (Respiration Activity Monitoring System) Anlage verglichen. Es zeigte sich sowohl in den Daten der Biomasse, als auch in den Daten der Sauerstofftransferraten (oxygen transfer rate - OTR), dass der Metabolismus durch die Induktion mit dem Lactose-Analogon Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) bei hohen Temperaturen deutlich stärker belastet war, als bei geringen Temperaturen. Außerdem reichten bereits geringe Induktorkonzentrationen (0.5 - 0.1 mM IPTG) aus, um eine hohe Produktbildung zu erzielen. OTR Daten liefern viele Information über den metabolischen Zustand einer Kultur. Bisher ist die Messung in Mikrotiterplatten in kommerziell verfügbaren Geräten aber nicht möglich. Die sichtbaren Zusammenhänge von OTR und Biomasse-basiertem Streulicht wurden deshalb im Rahmen der Arbeit genauer untersucht. Für E. coli konnte gezeigt werden, dass die erste Ableitung der Streulichtverläufe proportional zu den OTR Verläufen ist. Die Streulichtdatenkönnen somit in vielen Fällen zur Interpretation von physiologischen Zuständen dienen. Die Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) Fluoreszenz der Zellen konnte als zusätzliches Signal für die metabolische Belastung identifiziert werden. Zudem wurden zwei verschiedene Ansätze zur Vorhersage der rekombinanten Proteinbildung entwickelt. Aufwändige Analysetests sind für eine erste Abschätzung nicht mehr notwendig.