Characterization of Gluconobacter oxydans strains and development of a production process for 5-Ketofructose

Herweg, Elena Ruth; Büchs, Jochen (Thesis advisor); Deppenmeier, Uwe (Thesis advisor)

Aachen (2019)
Doktorarbeit

Kurzfassung

Gluconobacter oxydans wird oft für Oxidationen mit membrangebundenen Dehydrogenasen eingesetzt, jedoch sind bei der Bioprozessentwicklung geringe Biomasseausbeuten ein häufiges Problem. Eine mögliche Lösung ist eine genetische Modifikation des Glucosestoffwechsels von G. oxydans. In dieser Arbeit wurden ein Referenzstamm und zwei neue Stämme hinsichtlich Atmung und Produktbildung untersucht. In Kultivierungen des Referenzstammes G. oxydans 621H delta-upp in Schüttelkolben wurden zwei Wachstumsphasen für die Oxidation von Glucose zu Gluconat und weiter zu 2-Ketogluconat identifiziert. In kontinuierlicher Kultur überwog bei hohen Durchflussraten über 0.3 h-1 die direkte Oxidation von Glucose, während bei kleineren Durchflussraten auch 2-Ketogluconat, Acetat und mehr Biomasse gebildet wurde. In den neuen G. oxydans Stämmen wurde die direkte Oxidation von Glucose verhindert und die Glucose Verstoffwechselung verbessert. Dafür wurden die Gene der löslichen und der membrangebundenen Glucosedehydrogenase sowie der Pyruvatdecarboxylase deletiert. Die Gene für die im Zitratzyklus fehlenden Enzyme und Gene für Glucosetransporter wurden eingefügt. Das Wachstum der beiden neuen Stämme Mut1 und Mut2 war im Vergleich zum Referenzstamm verzögert, die Gluconatbildung konnte jedoch verhindert werden. Die optische Dichte und CO2-Bildung war in beiden Stämmen erhöht, was auf einen gesteigerten Kohlenstoffkatabolismus und Biomassebildung schließen lässt. Für die Produktion des potentiellen Süßstoffes 5-Ketofructose (5-KF) mit einem rekombinanten G. oxydans Stamm, der eine Fructosedehydrogenase überexprimiert, wurde ein Fed-Batch Prozess entwickelt. Auf eine Charakterisierung des Stammes im Schüttelkolben mittels Onlineüberwachung der Atmungsaktivität folgte ein Scale-Up in einen 2 L Fermenter. Für Fermentationen mit konstanter Fructosefütterung wurden Fructoseverbrauchsraten bestimmt. In Fermentationen mit konstantem Zulauf wurden bis zu 489 g/L 5-KF produziert und eine Produktausbeute von 0.98 g5-KF/g Fructose sowie eine Raum-Zeit-Ausbeute von 8.6 g/L/h erreicht. Die Fermentationen wurden bilanziert und die Stöchiometrie ermittelt. 5-KF wurde zusätzlich auch mit ruhenden Zellen hergestellt und mit Aktivkohle aufgereinigt, um eine reine 5-KF-Lösung ohne Medienbestandteile zu erhalten. Insgesamt konnte ein effizienter Fed-Batch Prozess zur Herstellung von 5-KF entwickelt werden.

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