Multiplexed intracellular single-cell sensing strategies of microorganisms integrated for cultivation in microfluidic devices

Bucher-Krämer, Christina Erna Maria; Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Kurzfassung

Intrazelluläre Messung in Mikroorganismen ist herausgefordernd durch deren schnelle Reaktion auf Umweltveränderungen und den Möglichkeiten von unbeeinträchtigenden Intrazellulärsonden für verlässliche Lebendeinzelzellanalyse. Die vorgelegte Doktorarbeit zeigt die Umsetzung von Multiplexfluoreszenzkonzepten zur Echtzeitbildgebung mit konventioneller Expression von Fluoreszenzfusionsproteinen und neuartiger, non-toxischer Fluoreszenz in situ Färbung (FISS) in kontrollierter mikrofluidischen Umgebung. Stressende Wachstumsbedingungen mit nachfolgenden Erholungsphasen wurden in mikrofluidischen Kultivierungssystemen simuliert um Verhalten von Zellen und deren Tochterzellen durch Zeit- und Einzelzell-aufgelöste Mikroskopie zu beobachten. Zunächst wurde die sporadische Promotoraktivität des SOS-Kaskadengens recA und die Induktion des Prophagen CGP3 unter stressfreien Bedingungen und unter Nährstoffarmut bestimmt. Die beteiligten Promotorinduktionen wurden durch spontan induzierte Induktion von Fusionsproteinfluoreszenzen in einem Baterium analysiert. Phänotypische Minderheitbildung und individuelle Zellschicksale wurden durch eyfp, e2-crimson und venus visualsiert. Desweiteren wurden neuartige non-invasive, unmittelbare Messmethoden ohne Anspruch auf genetische Modification entwickelt um heterogene Zellzustände wachsender Wildtypbakterien durch fluorogene Moleküle zu unterscheiden. Eine innovative Herangehensweise ergänzend zu konventionellen Kultur-basierten Methoden ist die Verwendung fluorogener Substrate mit Enzym-labilen funktionellen Gruppen für die Einzelzellanalyse. Folglich wurde Acetoxymethylester (AM) als Vektormolekülrest von aromatischen Verbindungen für C. glutamicum entdeckt. Dies wurde gezeigt durch Multiplexfluoreszenzbildgebung mit sechs fluorogenen AM-gekoppelten Sondenmolekülen zur Messung intrazellulärer Parameter (Metabolische Aktivität, Dormanz, Alterung, Zelllyse, apparenter Antibiotiktoleranz, Chemotoxizität, Phototoxizität, spontaner intrazellulärer Radikalbildung und intrazellulärem pH). Zudem wurde die Schutzfunktion der Zellwand oder der Zellmembran nativer Wildtypen durch neue Lebendzellmessung auf der Basis von dynamischer FISS mit Propidiumiodid und PO-PRO-1 untersucht. Der Funktionsverlust der Zellaußenbarrieren, programmierter Zelltod, Überlebendzellen mit entwickelnder non-Gen-basierter Antibiotikatoleranz und Resistenz gegenüber Gen-basierter Produktion eines lytischen Toxins wurden phänotypisch definiert durch diffusives Eindringen von Sondenmolekülen bei spezifischer Phänotypenentwicklung.

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