Development and application of a microfluidic batch cultivation device

  • Entwicklung und Anwendung eines mikrofluidischen Systems für Batch-Kulturen

Kaganovitch, Eugen; Kohlheyer, Dietrich (Thesis advisor); Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2021

Kurzfassung

Die Mikrofluidik hat auf dem Gebiet der bakteriellen Einzelzellanalyse zahlreiche Forschungsthemen ermöglicht. Insbesondere Einweg-Mikrofluidik-Chipsysteme in Kombination mit bildgebender Zeitraffer-Mikroskopie bieten einen effektiven Weg zur Untersuchung biologischer Phänomene auf Einzelzell-Level. Eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung ermöglichen die Identifizierung und das Verfolgen von individuellen Zellen und bieten so detaillierte Einsichten in die Physiologie der Zellen. Exakt kontrollierbare Umweltbedingungen in mikrofluidischen Kultivierungssystemen ermöglichen Studien zur phänotypischen Populationsheterogenität, die sich darin äußert, dass Zellen einer genetisch identischen Population Eigenschaften aufweisen, die sich von denen der Schwesterzellen unterscheiden. Sofern jene Eigenschaften deutlich ausgeprägt sind, spricht man von Phänotypen. Phänotypische Heterogenität kann sich zum Beispiel in der Expression bestimmter Proteine äußern und für das Überleben einer Bakterienpopulation entscheidend sein. Ferner kann phänotypische Populationsheterogenität erheblichen Einfluss auf biotechnologische Prozesse haben, bei denen meist die Produktion eines Proteins im Vordergrund steht. Hier würde sich die Ausbildung eines Phänotyps, der das Protein kaum produziert, aber dafür Nährstoffe verbraucht, ungünstig auf den Bioprozess auswirken. Deshalb ist die Entwicklung neuer mikrofluidischer Analyse-Tools von großer Bedeutung, um das Zustandekommen und die Auswirkungen von Populationsheterogenitäten besser verstehen zu können. Eine präzise Kontrolle externer Umweltfaktoren, wie etwa der Temperatur, pH-Wert oder der Konzentrationen bestimmter Stoffe im Kultivierungsmedium, ist dafür unabdingbar, weil dadurch diese Faktoren als mögliche Ursachen für die Ausbildung von Phänotypen ausgeschlossen werden können. Alternativ kann durch Variation eines externen Faktors dessen Einfluss auf das Verhalten von Zellen untersucht werden, sodass dieser Faktor als möglicher Trigger für Heterogenität identifiziert werden kann. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Entwicklung und Anwendung eines neuartigen Mikrofluidik-Systems für die Batch-Kultivierung von Mikroorganismen in einem räumlich isolierten Kulturvolumen bis zu einigen hundert Pikolitern. Bislang wurde in den meisten Systemen ein kontinuierlicher Mediumfluss zur Versorgung der Zellen mit Nährstoffen verwendet, sodass damit Einzelzell-Studien unter anderem unter konstanten Umweltbedingungen möglich waren. Jedoch war es damit nicht oder nur eingeschränkt möglich, Informationen zur Zellphysiologie in der stationären Phase zu gewinnen. Die Überwindung dieser technischen Limitation ist von großer Bedeutung für biologische und biotechnologische Anwendungen, da der Übergang in die stationäre Phase die Ausbildung von neuen Phänotypen hervorrufen kann. Basierend auf bewährter Polydimethylsiloxan (PDMS)-Chiptechnologie ermöglicht unser Batch-System die Analyse von Bakterienkolonien in abgeschlossenen Volumina im Pikoliter-Maßstab über 200 Stunden mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Die Herstellung basiert auf einem etablierten "Soft lithography"-Prozess und trägt in Kombination mit einer einfachen Bedienung des Chips zur günstigen und effizienten Anwendung bei. In dieser Arbeit werden zwei Anwendungen des Batch-Systems behandelt. Im Rahmen von Machbarkeitsstudien wurde das Wachstum von Escherichia coli unter Batch-Bedingungen untersucht. Dabei wurde die Zellzahl in Abhängigkeit von der Menge der Kohlenstoffquelle bestimmt, die in den Kultivierungsvolumina zur Verfügung stand. In der zweiten Anwendung wurde die Populationsheterogenität von Bacillus subtilis während eines Nährstoffmangels untersucht. B. subtilis bildet unter Nährstoffmangel unter anderem einen speziellen Phänotyp aus, der verstärkt antimikrobielle Peptide produziert, bevor die Zellen letztendlich Sporen bilden. Diese Peptide können sensitive Schwesterzellen abtöten und lysieren. Durch die Korrelation der Produktion eines Peptids mit der Zellhüllenstress-Antwort waren wir zum ersten Mal in der Lage, bakteriellen "Kannibalismus" auf Einzelzell-Niveau zu untersuchen.

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