Entwicklung von Online Messtechnik

 

Am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik wurden zahlreiche Geräte entwickelt, welche die Bioprozessentwicklung im Kleinkulturmaßstab deutlich beschleunigen und effizienter machen. Als Aushängeschild seien hier die RAMOS-Messtechnik und die Entwicklung des BioLectors genannt, welche von den Firmen Hitec Zang, der Adolf Kühner AG und der m2p-labs GmbH weiterentwickelt wurden und kommerziell vertrieben werden.

Ramos-Messtechnik

Die RAMOS-Messtechnik (Respiration Activity MOnitoring System) ermöglicht es die Atmungsaktivität von Mikroorganismen (Sauerstoff- und Kohlendioxidtransferrate und Respirationsquotient) standardmäßig in bis zu acht Schüttelkolben online zu überwachen^1,2.Der parallele Betrieb von bis zu 16 online überwachten Schüttelkolben in einer Anlage ist ebenfalls möglich. Die Aufzeichnung der Atmungsaktivität liefert die umfassendsten Informationen über einen Bioprozess und beschleunigt so die Bioprozessentwicklung. Es lassen sich Rückschlüsse auf die aerobe Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen ziehen und Effekte wie Sauerstoff- und Substratlimitierung, Produktinhibierung oder Diauxie erkennen. Die RAMOS-Messtechnik wird fortlaufend weiterentwickelt. So ist neben der Messung des Sauerstoffpartialdruckes auch die Messung des Kohlenstoffdioxidpartialdruckes möglich. Diese Messtechnik wurde erfolgreich in der Kuhner TOM realisiert und kann in Zukunft kommerziell erworben werden. Mit der AnaRAMOS und SynRAMOS kann das Wachstum anaerob lebender, sowie auf gasförmigen Kohlenstoffquellen wachsender Mikroorganismen überwacht werden^3,4. Auch die Überwachung exotischer Gase wie Ethylen ist möglich⁵. Die RAMOS-Messtechnik wurde ursprünglich für Schüttelkolben entwickelt und konnte in Form der µRAMOS erfolgreich auf den Mikrotiterplattenmaßstab übertragen werden⁶.

COSBIOS

Mit dem COSBIOS System (Continuously Operated Shaken BIOreactor System) kann die biologische Prozessentwicklung und –charakterisierung eines kontinuierlich betriebenen Prozesses im Schüttelreaktormaßstab durchgeführt werden^7,8. Die so erhaltenen Fermentationsdaten über die Produktbildungseigenschaften der kultivierten Mikroorganismen sind außerordentlich wertvoll für die Auslegung eines kontinuierlich betriebenen Prozesses. Das System besteht aus acht Glaszylindern, welche mit jeweils einem Überlauf versehen sind. Über zwei separate Ports wird das System über den Kopfraum begast und mit einer Feedlösung versorgt. Das Füllvolumen beträgt lediglich 15-25 mL. Nach dem Erreichen eines Fließgleichgewichtes stehen bereits acht Werte eines sog. X/D-Diagrammes zur Verfügung. Gegenüber einzelnen Rührreaktoren, mit denen die Fließgleichgewichte bei verschiedenen Durchflussraten nacheinander angefahren werden müssen, hat das COSBIOS-System einen erheblich reduzierten Ressourcen-, Zeit- und Arbeitsaufwand zur Folge.

ViMOS

Bei manchen mikrobiellen Kultursystemen ist über den Kultivierungsverlauf eine Änderung der Viskosität zu beobachten. Die Ursache kann die Auflösung von polymeren Medienbestandteilen oder die Bildung von Biopolymeren sein. Insbesondere bei der biologischen Prozessentwicklung von filamentös wachsenden Mikroorganismen stellt die Änderung der Viskosität über den zeitlichen Kultivierungsverlauf einen zentralen Aspekt dar. Das ViMOS System (Viscosity MOnitoring System) ermöglicht es die Viskosität in acht Schüttelkolben online und kontaktfrei zu messen⁹. Hierbei wird das Phänomen genutzt, dass es bei ansteigender Viskosität der Kultivierungsbrühe zu einer zunehmenden relativen Phasenverschiebung zwischen der Bewegung der Flüssigkeitssichel im geschüttelten Kolben und der kreisenden Richtung der Zentrifualbeschleunigung kommt. Der Phasenwinkel der Flüssigkeit wird hierbei über einen optischen Aufbau detektiert. Das ermöglicht es, basierend auf einer zuvor durchgeführten Kalibrierung, auf die Viskosität zurückzurechnen. Die ViMOS-Technik kann ohne weiteres mit der RAMOS-Technik gekoppelt werden.

BioLector

Die BioLector-Technik, mit der Fermentationen im geschüttelten Mikrotiterplattenmaßstab spektroskopisch online überwacht werden können, wurde am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik erfunden¹⁰. Das System besteht aus einer Temperiereinheit mit einem Schüttler, auf dem sich eine Mikrotiterplatte befindet, und einem Spektrometer mit einem Lichtwellenleiter, welcher an einer Verfahreinheit befestigt ist. Die Verfahreinheit fährt im laufenden Betrieb den Lichtwellenleiter nacheinander unter die einzelnen Wells der Mikrotiterplatte, sodass die Wells spektroskopisch vermessen werden können. Aus den Daten des so aufgezeichneten Streulichts und der Fluoreszenz können die Biomassekonzentration und biogene Fluoreszenzen von z.B. Tryptophan, NADH oder Riboflavin online charakterisiert werden. Werden exprimierte Zielproteine mit Fluoreszenzproteinen fusioniert (getaggt), lässt sich die Produktbildung online verfolgen. Mit kommerziell erhältlichen Sensorspots kann zudem die Sauerstoffsättigung und der pH-Wert in der Fermentationsbrühe online verfolgt werden. An der AVT.BioVT wurde die BioLector-Technik erstmals mit einem Pipetierrobotter gekoppelt (RoboLector)¹¹. Das erlaubt vollständig automatisierte Versuche^12,13,14,15 . Weiterhin wurde mit einem Kooperationspartner das Grundprinzip der sog. BioLectorPro-Technik entwickelt. Dabei werden Mikrotiterplatten verwendet, die mit einer speziellen Mikrofluidik versehen sind^16,17. Auf diese Weise lassen sich pH-regulierte Kulturen oder eine Fed-batch Fahrweise mit frei wählbarem Fütterprofil realisieren. Um in den BioLectoren Kultivierungen ohne Sauerstofflimitationen durchführen zu können, wurde die sog. Flowerplate entwickelt¹⁸. Dabei wurden unterschiedlich stromgestörte Well-Geometrien nach verschiedenen Kriterien optimiert. Die Flowerplate bietet maximale Sauerstofftransferkapazitäten, die denjenigen von Rührreaktoren nahe kommen. Mit Hilfe eines eigens angefertigten Temperaturblocks, kann zudem ein Temperaturgradient über eine Mikrotiterplatte gelegt werden. So kann in einem einzigen Versuch die Temperaturabhängigkeit von mikrobiologischen Systemen untersucht werden¹⁹.

Aus einer Kombination des BioLectors mit der µRAMOS-Technik ist zudem ein Gerät entstanden, welches es ermöglicht zusätzlich die Atmungsaktivität der Mikroorganismen zu messen²⁰. Eine weitere nennenswerte Weiterentwicklung des BioLectors stellt der 2D-BioLector dar. Dieser ist in der Lage nicht nur definierte einzelne Wellenlängenkombinationen zu messen, sondern gesamte 2D-Spektren in allen Wells über der Zeit²¹. Dadurch stehen extrem viele Informationen zur Auswertung zur Verfügung. Das erlaubt sogar die Konzentrationen von nicht optisch reagierenden Substanzen wie z.B. Glucose oder Glycerin vorher zu sagen.

Überwachung von Fermentationsprozessen

Neben der Entwicklung ganzer Messsysteme werden an der AVT.BioVT auch einzelne Komponenten und neue Ansätze zur Überwachung und Charakterisierung von Fermentationsprozessen entwickelt. Die folgende Auflistung nennt beispielhaft einige Entwicklungen in diesem Gebiet:

• Messung der gelöst-CO Konzentration in der Syngasfermentation in Rührreaktoren²²
• Charakterisierung von mikroaerophilen Prozessen²³
• Online Bestimmung der Viskosität im 50 L-Druckfermenter über Kalorimetriemessung²⁴

Bei Fragen zu den genannten Themengebieten erreichen Sie uns über die angegebene Ansprechperson.

Wir bieten fortlaufend Abschlussarbeiten zu den genannten Themengebieten an. Ausschreibungen finden Sie im Angebot der Studien- und Abschlussarbeiten der AVT (Zugriff nur aus dem RWTH-Netz). Zudem können Sie uns jederzeit gerne eine Initiativbewerbung über unser Sekretariat zukommen lassen.

 

Quellen

¹ Anderlei, T., & Büchs, J. (2001). Device for sterile online measurement of the oxygen transfer rate in shaking flasks. Biochemical Engineering Journal, 7(2), 157-162.

² Anderlei, T., Zang, W., Papaspyrou, M., & Büchs, J. (2004). Online respiration activity measurement (OTR, CTR, RQ) in shake flasks. Biochemical Engineering Journal, 17(3), 187-194.

³ Mann, M, Wittke, D, Büchs, J. Online monitoring applying the anaerobic respiratory monitoring system reveals iron(II) limitation in YTF medium for Clostridium ljungdahlii. Eng Life Sci. 2020; 1‐ 10. https://doi.org/10.1002/elsc.202000054

⁴ Mann, M., Hüser, A., Schick, B., Dinger, R., Miebach, K., & Büchs, J. (2021). Online monitoring of gas transfer rates during CO and CO/H₂ gas fermentation in quasi‐continuously ventilated shake flasks. Biotechnology and Bioengineering, 1– 13. https://doi.org/10.1002/bit.27722

⁵ Schulte, A., Schilling, J.V., Nolten, J. et al. Parallel online determination of ethylene release rate by Shaken Parsley cell cultures using a modified RAMOS device. BMC Plant Biol 18, 101 (2018). https://doi.org/10.1186/s12870-018-1305-6

⁶ Flitsch, D., Krabbe, S., Ladner, T., Beckers, M., Schilling, J., Mahr, S., ... & Büchs, J. (2016). Respiration activity monitoring system for any individual well of a 48-well microtiter plate. Journal of Biological Engineering, 10(1), 1-14.

⁷ Sieben, M., Steinhorn, G., Müller, C., Fuchs, S., Ann Chin, L., Regestein, L., & Büchs, J. (2016). Testing plasmid stability of Escherichia coli using the continuously operated shaken BIOreactor system. Biotechnology Progress, 32(6), 1418-1425.

⁸ Akgün, A., Müller, C., Engmann, R. et al. Application of an improved continuous parallel shaken bioreactor system for three microbial model systems. Bioprocess Biosyst Eng 31, 193–205 (2008). https://doi.org/10.1007/s00449-007-0183-3

⁹ Sieben, M., Hanke, R., & Büchs, J. (2019). Contact-free determination of viscosity in multiple parallel samples. Scientific reports, 9(1), 1-10.

¹⁰ Samorski, M., Müller‐Newen, G., & Büchs, J. (2005). Quasi‐continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnology and Bioengineering, 92(1), 61-68.

¹¹ Huber, R., Ritter, D., Hering, T. et al. Robo-Lector – a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact 8, 42 (2009). https://doi.org/10.1186/1475-2859-8-42

¹² Mühlmann, M., Kunze, M., Ribeiro, J. et al. Cellulolytic RoboLector – towards an automated high-throughput screening platform for recombinant cellulase expression. J Biol Eng 11, 1 (2017). https://doi.org/10.1186/s13036-016-0043-2

¹³ Mühlmann, M., Forsten, E., Noack, S. et al. Optimizing recombinant protein expression via automated induction profiling in microtiter plates at different temperatures. Microb Cell Fact 16, 220 (2017). https://doi.org/10.1186/s12934-017-0832-4

¹⁴ Mühlmann, M.J., Forsten, E., Noack, S. and Büchs, J. (2018), Prediction of recombinant protein production by Escherichia coli derived online from indicators of metabolic burden. Biotechnol. Prog., 34: 1543-1552. https://doi.org/10.1002/btpr.2704

¹⁵ Mühlmann, M., Büchs, J. Automatisiertes Klonscreening und Vorhersage der Expressionsleistung. Biospektrum 24, 46–49 (2018). https://doi.org/10.1007/s12268-018-0891-z

¹⁶ Funke, M., Buchenauer, A., Schnakenberg, U., Mokwa, W., Diederichs, S., Mertens, A., Müller, C., Kensy, F. and Büchs, J. (2010), Microfluidic biolector—microfluidic bioprocess control in microtiter plates. Biotechnol. Bioeng., 107: 497-505. https://doi.org/10.1002/bit.22825

¹⁷ Funke, M., Buchenauer, A., Mokwa, W. et al. Bioprocess Control in Microscale: Scalable Fermentations in Disposable and User-Friendly Microfluidic Systems. Microb Cell Fact 9, 86 (2010). https://doi.org/10.1186/1475-2859-9-86

¹⁸ Funke, M., Diederichs, S., Kensy, F., Müller, C. and Büchs, J. (2009), The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations. Biotechnol. Bioeng., 103: 1118-1128. https://doi.org/10.1002/bit.22341

¹⁹ Kunze, M., Lattermann, C., Diederichs, S. et al. Minireactor-based high-throughput temperature profiling for the optimization of microbial and enzymatic processes. J Biol Eng 8, 22 (2014). https://doi.org/10.1186/1754-1611-8-22

²⁰ Ladner, T., Held, M., Flitsch, D., Beckers, M., & Büchs, J. (2016). Quasi-continuous parallel online scattered light, fluorescence and dissolved oxygen tension measurement combined with monitoring of the oxygen transfer rate in each well of a shaken microtiter plate. Microbial Cell Factories, 15(1), 206.

²¹ Ladner, T., Beckers, M., Hitzmann, B., & Büchs, J. (2016). Parallel online multi‐wavelength (2D) fluorescence spectroscopy in each well of a continuously shaken microtiter plate. Biotechnology Journal, 11(12), 1605-1616.

²² Mann, M, Miebach, K, Büchs, J. Online measurement of dissolved carbon monoxide concentrations reveals critical operating conditions in gas fermentation experiments. Biotechnology and Bioengineering. 2020; 1– 12. https://doi.org/10.1002/bit.27567

²³ Heyman, B., Tulke, H., Putri, S. P., Fukusaki, E., & Büchs, J. (2020). Online monitoring of the respiratory quotient reveals metabolic phases during microaerobic 2, 3‐butanediol production with Bacillus licheniformis. Engineering in Life Sciences, 20(3-4), 133-144.

²⁴ Schelden, M., Lima, W., Doerr, E. W., Wunderlich, M., Rehmann, L., Büchs, J., & Regestein, L. (2017). Online measurement of viscosity for biological systems in stirred tank bioreactors. Biotechnology and Bioengineering, 114(5), 990-997.